1. Determinazione della composizione cellulare nella sospensione cellulare utilizzando l'analisi Western Blot a cellula singola (scWB)
- Reidratare il chip scWB prima dell'uso in 15 mL di tampone di sospensione 1x in una capsula di Petri per almeno 10 minuti a RT.
- Aggiungere 1 mL di sospensione monocellulare diluita (10.000-100.000 cellule/mL) al chip reidratato. Appoggiare la superficie sul fondo di una capsula Petri da 10 cm. Assicurarsi che la superficie sia piana.
- Coprire la capsula di Petri con un coperchio per evitare che si secchi e lasciare riposare le cellule per 5-15 minuti con una pendenza.
- Posizionare il chip sotto un microscopio a campo chiaro e ispezionare i pozzetti con un ingrandimento di 10x.
nota: Circa il 15-20% dei micropozzetti dovrebbe essere occupato da una singola cella e meno del 2% dei pozzetti dovrebbe contenere 2 o più cellule.
- Inclinare di 45 gradi la capsula di Petri da 10 cm contenente la patatina.
- Lavare il chip con il tampone di sospensione 1x per rimuovere le cellule non catturate dalla superficie del chip mediante pipettaggio delicato dall'alto verso il basso del chip. Ripeti 3 volte.
- Preparare lo strumento Western a cella singola.
- Impostare il tempo di lisi, il tempo di elettroforesi e il tempo di acquisizione UV. Per analizzare i macrofagi reclutati recuperati dal tappo di gel derivato dalla membrana basale, utilizzare le seguenti impostazioni: tempo di lisi: 0 s; tempo di elettroforesi: 160 s; Tempo di cattura UV 240 s.
- Caricare con cautela il chip nella cella di elettroforesi dello strumento Western a cella singola, rivolto verso il gel. Prestare attenzione a non danneggiare il lato in gel del chip.
- Versare il tampone di lisi/funzionamento nella camera e coprire completamente l'intero chip Western a cella singola. Avviare la lisi cellulare.
- Eseguire lo strumento scWB utilizzando l'impostazione elencata in 1.8.
- Una volta completata la corsa, trasferire il truciolo in una piastra Petri da 10 cm e lavare il truciolo due volte con 1x tampone di lavaggio per 10 minuti a RT.
- Preparare diluizioni dell'anticorpo primario (anti-vinculina: 1:10; anti-CD45: 1:15, anti-CD11b: 1:20, anti-F4/80: 1:10) in un volume totale di 80 μl di diluente anticorpale (miscelare 8 μl di anticorpo 1 più 8 μl di anticorpo 2 più 64 μl di diluente).
- Aggiungere 80 μl della soluzione di anticorpi primari alla camera di sondaggio degli anticorpi e abbassare il chip con il lato del gel rivolto verso il basso in modo che la soluzione anticorpale penetri attraverso il chip.
- Incubare con la soluzione di anticorpi primari per 2 ore a RT.
- Lavare il truciolo tre volte per 10 minuti in 1x tampone di lavaggio sullo shaker.
- Lavare la patatina una volta per 10 minuti nell'acqua dello shaker per dissalare il gel.
- Preparare una diluizione 1:20 dell'anticorpo secondario in un volume totale di 80 μl (miscelare 2 μl di anticorpo secondario più 78 μl di diluente).
- Incubare il chip con un anticorpo secondario per 1 ora a RT al riparo dalla luce.
- Lavare il truciolo tre volte per 10 minuti con 1x tampone di lavaggio sullo shaker.
- Centrifugare il truciolo utilizzando una centrifuga scorrevole per rimuovere eventuali residui di lavaggio.
- Scansiona il chip su uno scanner microarray a doppio laser con risoluzione di 5 μm sul canale spettrale del fluoroforo accoppiato agli anticorpi secondari.
- Analizza i dati utilizzando un software specifico per scWB.
2. Rimozione del chip scWB
- Conservare il chip scansionato in un tampone di lavaggio fino al momento di essere rimosso.
- Mettere il bagnomaria in una cappa aspirante.
- Posizionare un rack per provette da 50 mL nel bagnomaria con l'acqua a solo 1 cm sopra il rack e impostare la temperatura dell'acqua a 60 °C.
- Preparare il tampone di stripping. Per 1 L di soluzione tampone stripping, sciogliere 9,85 g di Tris-HCl (pH 6,8) e 20 g di SDS in 900 mL di acqua distillata e regolare il pH. Quindi riempire con acqua distillata fino a 1 litro. Aggiungere lo 0,8% (v/v) di β-mercaptoetanolo (β-ME; 14,3 M) immediatamente prima di ogni utilizzo.
- Dopo la scansione iniziale, posizionare il chip in una capsula di Petri di 10 cm prima di rimuoverlo.
- Per ogni chip, prelevare 40 mL di tampone di stripping e aggiungere 320 μl di β-ME.
ATTENZIONE: β-ME è tossico e pericoloso per l'uomo e l'ambiente. La seguente procedura deve essere eseguita in una cappa aspirante.
- Posizionare il chip nel contenitore e sigillare il contenitore con parafilm per evitare che l'acqua penetri nel contenitore
- Posizionare il contenitore all'interno della rastrelliera per provette nel bagnomaria preriscaldato.
- Incubare per 90 min.
- Rimuovi con cautela il chip dal contenitore e mettilo in una capsula di Petri fresca.
- Lavare brevemente il truciolo una volta con 1x tampone di lavaggio. Quindi aggiungere 15 mL di tampone di lavaggio 1x alla piastra di Petri.
- Lavare le patatine per 15 minuti su uno shaker. Ripetere la fase di lavaggio quattro volte.
nota: Il chip è pronto per il successivo anticorpo primario (vedere i passaggi 1.12 - 1.21)
