Saggio di Western Blot chemiluminescente per la lavorazione delle proteine

Abstract

Fonte: Hillert-Richter, L. K. et al., Misurazione della composizione del complesso di segnalazione CD95 che induce la morte e l'elaborazione della procaspasi-8 in questo complesso. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video descrive il western blotting basato sulla chemiluminescenza di lisati immunoprecipitati. La tecnica aiuta a determinare l'elaborazione e l'attivazione delle proteine. Il segnale chemiluminescente rilevato è proporzionale al livello di elaborazione delle proteine durante la sua attivazione.

Protocollo

Gli esperimenti sulle cellule T sono stati eseguiti secondo l'accordo etico 42502-2-1273 Uni MD.

1. Preparare le cellule per l'esperimento

NOTA: Il numero medio di cellule per questa immunoprecipitazione è 1 × 10⁷. Le cellule aderenti devono essere seminate un giorno prima dell'esperimento in modo che ci siano 1 × 10⁷ cellule il giorno dell'esperimento.

1. Preparazione delle cellule aderenti per l'esperimento
   1. Seminare 5-8 × 10⁶ cellule aderenti in 20 mL di terreno (vedere la Tabella dei materiali per la composizione) per ciascuna condizione in piatti da 14,5 cm un giorno prima dell'inizio dell'esperimento.
   2. Il giorno dell'esperimento, assicurarsi che le cellule siano confluenti all'80-90% e aderenti al piatto. Scartare il terreno e aggiungere terreno fresco alle cellule aderenti.
2. Preparazione delle celle di sospensione per l'esperimento
   1. Posizionare con cautela 1 × 10⁷ cellule in sospensione in 10 mL di terreno di coltura (vedere la Tabella dei materiali per la composizione) per condizione in piastre da 14,5 cm immediatamente prima dell'inizio dell'esperimento.
   2. Se si utilizzano cellule primarie, isolare le cellule T primarie secondo la procedura descritta in precedenza. Trattare le cellule T primarie con 1 μg/mL di fitoemoagglutinina per 24 ore, seguito da un trattamento con 25 U/mL di IL2 per 6 giorni.
   3. Posizionare con cura 1 × 10⁸ cellule T primarie in 10 mL di terreno di coltura (vedere la Tabella dei materiali per la composizione) per condizione in piastre da 14,5 cm immediatamente prima dell'inizio dell'esperimento.
      nota: Si raccomanda questo numero più elevato di cellule T primarie, poiché queste cellule sono più piccole.

2. Stimolazione CD95L

1. Stimolare le cellule con CD95L (prodotto come descritto in precedenza o disponibile in commercio (vedi Tabella dei Materiali).
   nota: La concentrazione del CD95L e il tempo di stimolazione dipendono dal tipo di cellula. Preparare due volte una condizione di stimolazione per generare un campione di "controllo del microschino" in parallelo.
   1. Stimola le cellule aderenti con la concentrazione selezionata di CD95L. Tenere la piastra inclinata e pipettare il ligando nel terreno senza toccare le cellule aderenti.
   2. Stimolare le cellule in sospensione con CD95L pipettando la soluzione del ligando nella sospensione cellulare.

3. Raccolta e lisi delle cellule

1. Metti le piastre cellulari sul ghiaccio.
   nota: Non gettare il mezzo. Le cellule morenti galleggiano nel terreno e sono importanti per l'analisi.
2. Aggiungere 10 mL di soluzione salina fredda tamponata con fosfato (PBS) alla sospensione cellulare e raschiare le cellule attaccate dalla piastra. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 50 mL.
3. Lavare due volte la piastra cellulare con 10 ml di PBS freddo e inserire la soluzione di lavaggio nella stessa provetta da 50 ml. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g per 5 min, 4 °C.
4. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 1 mL di PBS freddo. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 1,5 mL.
5. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g per 5 min, 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 1 mL di PBS freddo.
6. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g per 5 min, 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 1 mL di tampone di lisi (contenente un cocktail di inibitori della proteasi al 4%). Incubarlo per 30 minuti con ghiaccio.
7. Centrifugare il lisato alla massima velocità (~17.000 × g) per 15 min, 4 °C.
8. Trasferire il surnatante (lisato) in una provetta pulita. Scartare il pellet. Prelevare 50 μl di lisato in un'altra provetta. Analizzare la concentrazione proteica mediante saggio di Bradford e prelevare la quantità di lisato corrispondente a 25 μg di proteine in una fiala. Aggiungere il tampone di caricamento (vedere la Tabella dei materiali per la composizione) alla fiala. Conservarlo a -20 °C come controllo del lisato.

4. Immunoprecipitazione (IP)

1. Aggiungere 2 μL di anticorpi anti-APO-1 e 10 μL di perle di proteina A sefarosio (preparate come raccomandato dal produttore) al lisato. Aggiungere solo 10 μl delle perle a una provetta separata contenente lisato (campione stimolato) per generare un "controllo delle microsfere"
   nota: Utilizzare puntali per pipette con orifizi larghi tagliando i puntali o acquistando puntali speciali per IP mentre si maneggiano le perle di proteina A sefarosio.
2. Incubare la miscela di lisato con anticorpi/perle di proteina A sefarosio mescolando delicatamente per una notte a 4 °C. Centrifugare i lisati con anticorpi/perle di proteina A di sefarosio a 500 × g per 4 minuti, 4 °C. Scartare il surnatante, aggiungere 1 ml di PBS freddo alle perle e ripetere questo passaggio almeno tre volte.
3. Scartare il surnatante. Aspirare le perle preferibilmente con una siringa Hamilton da 50 μL.

5. Macchia occidentale

1. Aggiungere 20 μl di tampone di caricamento 4x (vedere la Tabella dei materiali per la composizione) alle perle e riscaldare a 95 °C per 10 minuti. Riscaldare i controlli del lisato a 95 °C per 5 minuti.
2. Caricare i lisati, gli IP e uno standard proteico su un gel di dodecil solfato di sodio (SDS) al 12,5% (vedere la Tabella dei materiali per la preparazione del gel) e far funzionare con una tensione costante di 80 V.
3. Trasferire le proteine dal gel SDS a una membrana di nitrocellulosa.
   nota: Qui, la tecnica semi-secca, ottimizzata per le proteine di interesse, è stata utilizzata per il trasferimento su 12 min (25 V; 2,5 A= costante). Immergere la membrana in nitrocellulosa e due pile di trasferimento di dimensioni ridotte in un tampone per elettroforesi (vedere la Tabella dei materiali per la composizione, preparare secondo le istruzioni del produttore) per alcuni minuti prima del western blotting.
4. Mettere la membrana tamponata in una scatola e bloccarla per 1 ora in una soluzione bloccante (0,1% Tween-20 in PBS (PBST) + 5% latte). Incubare la membrana con la soluzione bloccante agitando delicatamente.
5. Lavare la membrana tre volte con PBST per 5 minuti ogni lavaggio.

6. Rilevamento Western blot

1. Aggiungere il primo anticorpo primario alla diluizione indicata (vedi Tabella dei materiali) alla membrana e incubarlo per una notte a 4 °C con leggera agitazione.
2. Lavare la membrana tre volte con PBST per 5 minuti ogni lavaggio.
3. Incubare la membrana con 20 mL di anticorpo secondario (diluito 1:10.000 in PBST + 5% di latte) agitando delicatamente per 1 ora a temperatura ambiente.
4. Lavare la membrana tre volte con PBST per 5 minuti ogni lavaggio.
5. Scartare PBST e aggiungere circa 1 mL di substrato di perossidasi di rafano alla membrana.
6. Rileva il segnale chemiluminescente (vedi Tabella dei materiali).
   nota: Il tempo di esposizione e il numero di immagini acquisite dipendono dalla quantità di proteine nella cellula e dalla specificità degli anticorpi utilizzati. Deve essere stabilito empiricamente per ogni anticorpo utilizzato per la rilevazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
12,5% di gel SDS	Autoprodotto		Per due gel separatori: 3,28 mL di H2O distillato, 2,5 mL di Tris; pH 8,8; 1,5 M, 4,06 mL, acrilammide, 100 μL, 10% SDS, 100 μL, APS, 7,5 μL TEMED per due gel di raccolta: 3,1 mL di H2O distillato, 1,25 mL di Tris; pH 6,8; 1,5 M, 0,5 mL di acrilammide, 50 μL, 10% SDS, 25 μL, 10% APS, 7,5 μL, TEMED
Piastre cellulari da 14,5 cm	Greiner	Codice 639160
acrilamide	Carl Roth	A124.1
Puntali per pipette con filtro ad alto recupero e ampio orifizio	VWR	46620-664 (Nord America) o 732-0559 (Europa)	Utilizzato per pipettare le perle nel lisato
Utilizzato per pipettare le perle nel lisato	Sigma Aldrich	Codice: A2103	Diluizione: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Ab	Fornito in questi esperimenti dal Prof. P. Krammer o acquistabile da ENZO	ALX-805-038-C100	Utilizzato solo per l'immunoprecipitazione
anti-caspasi-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	Diluizione: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspasi-3 Ab	Segnalazione cellulare	9662 S	Diluizione: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspasi-8 Ab C15	Fornito in questi esperimenti dal Prof. P. Krammer o acquistabile da ENZO	ALX-804-242-C100	Diluizione: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 Ab	Santa Cruz	SC-715	Diluizione: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab	Fornito in questi esperimenti dal Prof. P. Krammer o acquistabile da ENZO	ALX-804-961-0100	Diluizione: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab	Fornito in questi esperimenti dal Prof. P. Krammer o acquistabile da ENZO	ADI-AAM-212-E	Diluizione: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP Ab	Segnalazione cellulare	Codice: 9542	Diluizione: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
Aps	Carl Roth	Codice 9592,3
β-mercaptoetanolo	Carl Roth	4227.2
Bradford soluzione Protein Assay Dye Reagente Concentrato 450ml	Rabbia bio	500-0006	Utilizzato secondo le istruzioni del produttore
CD95L	Fornito in questi esperimenti dal Prof. P. Krammer o acquistabile da ENZO	ALX-522-020-C005
Rivelatore a chemiluminescenza Chem Doc XRS+	Rabbia bio
Cocktail completo di inibitori della proteasi (PIC)	Sigma Aldrich	ALX-522-020-C005	Preparato secondo le istruzioni del produttore
DPBS (10x) senza Ca, Mg	PAN Biotecnologie	P04-53500	Diluizione 1:10 con H2O, conservazione in frigorifero
Tampone per elettroforesi	Autoprodotto		10x tampone per elettroforesi: 60,6 g Tris, 288 g glicina, 20 g SDS e 2 L H2O, diluizione 1:10 prima dell'uso
glicina	Carl Roth	3908,3
Capra Anti-Topo IgG1 HRP	Biotecnologie meridionali	Codice: 1070-05	Diluizione 1:10.000 in PBST + 5% latte
IgG2b HRP anti-topo di capra	Biotecnologie meridionali	Codice 1090-05	Diluizione 1:10.000 in PBST + 5% latte
IgG-HRP anti-coniglio di capra	Biotecnologie meridionali	Codice 4030-05	Diluizione 1:10.000 in PBST + 5% latte
Interleuchina-2 Umana (hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	Per l'attivazione delle cellule T
Kcl	Carl Roth	Codice 6781.2
KH2PO4	Carl Roth	3904.1
Tampone di caricamento 4x Laemmli Sample Buffer, 10 mL	Rabbia bio	Codice 161-0747	Preparato secondo le istruzioni del produttore
Substrato Luminata Forte Western HRP	Millipore	WBLUFO500
Tampone di lisi	Autoprodotto		13,3 mL di Tris-HCl; pH 7,4; 1,5 m, 27,5 mL di NaCl; 5 m, 10 mL di EDTA; 2 mM, 100 mL di Triton X-100, aggiungere 960 mL di H2O
Terreno per cellule aderenti DMEM F12 (1:1) con glutammina stabile, 2.438 g/L	PAN Biotecnologie	P04-41154	Aggiunta del 10% di FCS, dell'1% di penicillina-streptomicina e dello 0,0001% di puromicina al terreno
Terreno per cellule T primarie	gibco di Life Technologie	21875034	Aggiunta del 10% di FCS e dell'1% di penicillina-streptomicina al terreno
Latte in polvere	Carl Roth	T145.4
Na2HPO4	Carl Roth	P030.3
NaCl	Carl Roth	Codice 3957.2
PBST	Autoprodotto		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56,8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 Copyright © 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com Pagina 3 di 3 20 mL Tween-20 ad 2 L Diluizione H2O 1:20 prima dell'uso
PBST + 5% latte	Autoprodotto		50 g di latte in polvere + 1 L di PBST
Pha	Thermo Fisher Scientifico	R30852801	Per l'attivazione delle cellule T
Pac di alimentazione HC	Rabbia bio
Precision Plus Protein Standard Tutto Blu	Rabbia bio	Codice 161-0373	Utilizzare tra 3-5 μl
Proteina A Sepharose CL-4B perline	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	Perle di resina Affinity preparate secondo le istruzioni del produttore
raschietto	VWR	734-2602
Sds	Carl Roth	4360.2
scuotitore	Heidolph
Aziduro di sodio	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	Codice 2367,3
Pile di trasferimento Trans Blot Turbo mini-size	Rabbia bio	170-4270	Utilizzato secondo le istruzioni del produttore
Buffer di trasferimento TransBlot Turbo 5x	Rabbia bio	10026938	Preparato secondo le istruzioni del produttore
TransBlot Turbo Membrana in nictrocellulosa di dimensioni mini	Rabbia bio	170-4270	Utilizzato secondo le istruzioni del produttore
Trans-Blot-Turbo	Rabbia bio
Tris	Soluto chimico	8,08,51,000
Triton X-100	Carl Roth	Codice 3051.4
Interpolazione-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000