1. Preparazione del DNA genomico e digestione con enzima di restrizione
- Preparare gDNA da cellule staminali embrionali (cellule ES) utilizzando un kit commerciale (kit di purificazione del DNA genomico) con piccole modifiche.
- Rimuovere i terreni dalla coltura cellulare ES e aggiungere 500 μL di soluzione di lisi dei nuclei, inclusa la RNaseA, direttamente ai pozzetti per lisare le cellule.
nota: Il lisato cellulare può essere conservato a -80 °C o trattato immediatamente.
- Pipettare su e giù più volte per lisare completamente le cellule e trasferirle in una provetta pulita da 1,5 ml.
- Aggiungere un terzo del volume della soluzione di precipitazione proteica alla provetta da 1,5 mL, agitare energicamente per 20 s, raffreddare i campioni su ghiaccio per 5 min, quindi centrifugare a una forza di 2.000 x g per 5 min. Trasferire il surnatante in un'altra provetta pulita da 1,5 mL contenente un volume uguale di isopropanolo; mescolare delicatamente la soluzione. (Si noti che in questo momento si possono vedere fili bianchi simili a fili.) Centrifugare ad una forza di 2.000 x g per 1 min; Quindi, scartare il surnatante.
- Lavare il pellet di gDNA con 1 mL di etanolo al 70% a temperatura ambiente, centrifugare a una forza di 2.000 x g per 1 minuto, aspirare accuratamente il surnatante e quindi asciugare il pellet di gDNA all'aria per 3 minuti.
- Sciogliere i gDNA con 100 μL di soluzione di reidratazione del DNA e, quindi, incubare a 65 °C per 1 ora o a 4 °C per una notte.
- Conservare i gDNA a 2-8 °C.
- Digerire i gDNA con RE Dra I preprogettato. Impostare una reazione di digestione da 30 μl mescolando 3 μl di tampone 10x per Dra I, 3 μl di Dra I, 10 μg di gDNA/campione e H2O fino a 30 μl e incubare a 37 °C durante la notte.
- Verificare la completezza della digestione mediante gel di DNA, analizzando 5 μL della reazione digerita, quindi aggiungere i 3 μL di tampone di caricamento del DNA 10x per il passaggio successivo.
2. Tamponamento meridionale
- Screening del Southern blotting
- Separare i gDNA digeriti mediante elettroforesi e trasferirli su una membrana.
- Preparare un gel per elettroforesi di agarosio all'1% con bromuro di etidio (EB), caricare i campioni di gDNA digeriti e una scala da 1 kb ed eseguire il gel a bassa tensione (30-40 V) durante la notte.
- Estrarre il gel e scattare una foto con un sistema di imaging su gel di DNA dopo l'elettroforesi. Controlla se i gDNA digeriti e separati mostrano un'immagine simile a uno striscio.
- Immergere il gel in una vaschetta con una soluzione di HCl 0,2 N e agitarlo delicatamente per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Trasferire il gel in una soluzione denaturante del DNA e agitarlo delicatamente per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Trasforma il gel in una soluzione neutralizzante del DNA e agitalo delicatamente per 20 minuti a temperatura ambiente.
nota: Il gel è soggetto a rotture dopo questo passaggio, quindi deve essere maneggiato con cura.
- Utilizzare il sistema di trasferimento rapido verso il basso per trasferire il DNA dal gel alla membrana. Assemblare il TurboBlotter e la pila di tamponamento secondo le istruzioni fornite dal produttore.
NOTA: Come tampone di trasferimento viene utilizzata una soluzione salina o 20 di citrato di sodio (SSC). In generale, 3 ore di trasferimento sono sufficienti per trasferire il 95% dei gDNA dal gel alla membrana; Tuttavia, un tempo di trasferimento più lungo è innocuo.
- Estrarre la membrana e lavarla con 2x SSC per 1 minuto, assorbire il liquido con i fazzoletti, quindi reticolare il DNA con la membrana utilizzando un reticolante UV.
nota: La membrana può essere conservata a 4 °C per una settimana.
- Etichettare le sonde di DNA con la radioattività.
- Purificare i plasmidi della sonda utilizzando un kit miniprep secondo il protocollo fornito dal produttore.
- Rilasciare i frammenti di DNA delle sonde dal vettore plasmidico mediante digestione EcoR I in una soluzione di reazione comprendente 5 μL di tampone per EcoR I, 2 μL di enzima EcoR I, 20 μg di DNA plasmidico e H2O fino a 50 μL, per 2 ore.
- Eseguire un gel di DNA all'1% per separare i frammenti di DNA della sonda dal vettore e purificare i frammenti di DNA delle sonde con un kit di estrazione del gel di DNA secondo il protocollo fornito dal produttore.
- Utilizzando 1 μL della soluzione di DNA, misurare la concentrazione di DNA dei frammenti di DNA della sonda con uno spettrofotometro a una lunghezza d'onda di 260/280 nm.
- Preparare 40 ng di DNA sonda in una provetta da 1,5 ml con 45 μl di tampone TE, far bollire per 3 minuti, centrifugare brevemente e quindi mettere le provette sul ghiaccio per 2 minuti.
- Aggiungere i DNA della sonda denaturati a caldo nella provetta contenente le perle di marcatura del DNA (-dCTP) pronte all'uso, pipettare su e giù per mescolare, aggiungere 5 μL di [α32P]dCTP e incubare a 37 °C per 15 minuti.
- Purificare le sonde marcate utilizzando microcolonne G-50 secondo le istruzioni fornite dal produttore e, quindi, misurare la radioattività con un contatore a scintillazione (opzionale).
- Ibridare la/e membrana/e con le sonde marcate.
- Preibridare la membrana.
- Preriscaldare la soluzione di ibridazione a 42 °C per 30 minuti. Mescolare 20 mL di soluzione di ibridazione preriscaldata con 200 μg di DNA di sperma di salmone bollito in una provetta da 50 mL.
- Posizionare la membrana nel tubo di ibridazione. Aggiungere la soluzione di preibridazione mista al tubo di ibridazione. Metterlo nel forno di ibridazione (impostare la cottura e la temperatura a 42 °C) e lasciare procedere la preibridazione per 30 min.
- Ibridare la membrana con la/e sonda/e marcata/e.
- Estrarre la provetta di ibridazione e versare la soluzione di preibridazione in una provetta da 50 mL; aggiungere la sonda denaturata (riscaldata a 100 °C per 3 min) del passaggio 2.1.2.7 a questa provetta e mescolare delicatamente.
nota: Ridurre le bolle che inducono.
- Rimettere la soluzione miscelata nella provetta di ibridazione ed eseguire l'ibridazione a 42 °C per una notte.
- Lavare la/e membrana/e per rimuovere le sonde non ibridate.
- Mettere la/e membrana/e in una teglia con 1x SSC + 0,1% SDS e agitare delicatamente a 55–60 °C per 10 minuti.
- Trasferire la/e membrana/e in un vassoio con 0,5x SSC + 0,1% SDS e agitare delicatamente a 55-60 °C per 10 minuti.
- Controllare la radioattività sulla/e membrana/e utilizzando un contatore Geiger portatile per decidere se è necessario un terzo lavaggio.
- Esporre la radioattività sulla membrana a pellicole radiografiche.
- Rimuovere il liquido dalla/e membrana/e lavata/e.
- Avvolgere la/e membrana/e con pellicola trasparente e fissarla nella cassetta di esposizione.
- Esporre la membrana a due fogli di pellicola radiografica in una camera buia.
- Posizionare la cassetta di esposizione a -80 °C durante la notte o più a lungo.
- Sviluppa i filmati per visualizzare i risultati. Valutare se un clone ES corrispondente è quello desiderato con la ricombinazione mirata o meno, in base alle dimensioni delle bande di DNA rilevate dalle sonde.
- Riibridare la stessa membrana con un'altra sonda dopo aver rimosso la sonda usata secondo la seguente procedura: estrarre la membrana usata, lavarla 1 volta con H2O pulito, quindi incubarla in soluzione di striping (55% formammide, 2% SSPE, 1% SDS, H2O) a 65 °C agitando delicatamente per 1-2 ore.
