Northern Blot per rilevare e quantificare microRNA specifici nell'estratto di RNA totale di tessuto vegetale

Abstract

Fonte: Tirumalai, V., et al. Analisi del blot di RNA per il rilevamento e la quantificazione dei microRNA vegetali. J. Vis. Exp. (2020)

In questo video, dimostriamo il northern blot, una tecnica di ibridazione per rilevare e quantificare i microRNA (miRNA) dall'RNA totale estratto dal tessuto vegetale.

Protocollo

1. Elettroforesi su gel

1. Arrestare la pre-corsa e lavare i pozzetti prima del caricamento del campione.
2. Riscaldare i campioni a 98 °C per 1 minuto e caricare i campioni caldi nel pozzetto utilizzando le punte capillari. Inserire la punta sul fondo del pozzetto in modo che il campione occupi uno strato sottile nel pozzetto.
3. Caricamento completo di tutti i campioni. Includere il caricamento del marcatore del decennio dell'RNA.
4. Far funzionare il gel a 80 V fino a quando il colorante blu di bromofenolo non cola quasi completamente. Il blu di bromofenolo scorre a 10 bp in un gel di acrilammide denaturante al 15%.

2. Preparazione per l'elettro-blotting

1. Tagliare la membrana di nylon N+ alle dimensioni di una lastra di vetro ed etichettare la membrana nell'angolo in alto a destra con una matita HB.
2. Posizionare delicatamente la membrana sulla superficie dell'acqua sterile, rivoltando il lato etichettato verso la superficie dell'acqua. Pre-immergere la membrana per 15 minuti.
3. Taglia 4 pezzi di carta assorbente I nelle dimensioni di un tampone di fibra.
4. Preparare il sandwich in gel posizionando il lato grigio della cassetta in un vassoio pulito.
5. Pre-bagnare il tampone in fibra e posizionarlo sopra la cassetta. Rimuovere le bolle d'aria.
6. Pre-bagnare un pezzo di carta assorbente in 1x TBE e posizionarlo sopra il tampone in fibra. Rimuovere le bolle d'aria arrotolando una pipetta di plastica sulla carta. Stendere un altro pezzo di carta assorbente pre-bagnata e rimuovere le bolle d'aria.
7. Rimuovere con cautela il gel dalla cassetta di scorrimento e posizionarlo sopra la configurazione a sandwich, in modo che il primo campione di RNA caricato sia rivolto verso destra.
8. Immergere delicatamente la membrana pre-imbevuta in 1x TBE e posizionarla sopra il gel, rivolto verso il basso con il lato etichettato. Stendere per eliminare le bolle d'aria.
9. Immergi un pezzo di carta assorbente, adagialo sulla membrana e rimuovi le bolle d'aria. Immergi un altro pezzo di carta assorbente, posizionalo sopra la configurazione del sandwich e rimuovi le bolle d'aria.
10. Completa il sandwich posizionando un tampone in fibra pre-bagnata sopra il setup e chiudendo saldamente la cassetta.
11. Posizionare la cassetta transblot nel modulo e riempire 1x TBE, pH 8,2, fino al segno di blotting.
12. Trasferimento a 10 V, pernottamento a 4 °C.
13. Dopo il trasferimento, posizionare la membrana umida su un foglio di carta e reticolare immediatamente l'RNA alla membrana mediante irradiazione con luce UV a 254 nm (120.000 μjoule/cm²). Il blot reticolato può essere conservato a 4 °C per un'ulteriore ibridazione.

3. Preparazione della sonda radiomarcata

1. Progettare una sonda che sia completamente complementare al piccolo RNA che deve essere rilevato.
2. Etichettare la sonda utilizzando ƳP32ATP (ottenuto da BRIT) alla sua estremità 5' combinando i componenti secondo la ricetta fornita nella Tabella 1.
3. Incubare la miscela di reazione di cui sopra a 37 °C per 30 minuti.
4. Separare l'ƳP32ATP non marcato dalla sonda utilizzando una colonna Sephadex G-25 secondo il protocollo del produttore.

4.Ibridazione del blot

1. Posizionare il blot reticolato, con il lato dell'RNA rivolto verso l'alto, all'interno di un flacone di ibridazione.
2. Miscelare energicamente il tampone di ibridazione ultrasensibile, aggiungerne 10 mL e incubare il blot all'interno di un forno di ibridazione mantenuto a 35 °C, con rotazione.
3. Eseguire la pre-ibridazione per 20 min.
4. Togliere la bottiglia dal forno e aggiungere delicatamente la sonda etichettata nel tampone di ibridazione.
5. Ibridare il blot a 35 °C, con rotazione per 12 h.
6. Dopo l'ibridazione, trasferire con cura la soluzione di ibridazione in una provetta da 15 mL. Questa soluzione può essere conservata a 4 °C fino al riutilizzo.
7. Eseguire un lavaggio rapido del blot per 2 minuti per rimuovere la soluzione di ibridazione in eccesso aggiungendo 2 tamponi SSC più 0,5% di SDS. Scartare la soluzione.
8. Incubare il blot con 2 tamponi SSC più 0,5% SDS per 35 °C, con rotazione per 30 minuti.
9. Lavare nuovamente la macchia con tampone SSC 0,5x più 0,5% SDS per 35°C, con rotazione per 30 min.
10. Posizionare la macchia all'interno di un coperchio di ibridazione, rimuovere il tampone in eccesso e sigillarlo.
11. Esporlo a uno schermo imager al fosforo privo di radiazioni durante la notte all'interno di una cassetta.
12. Rilevare il segnale di ibridazione utilizzando un imager biomolecolare e analizzare i risultati utilizzando un software adatto.

Tabella 1: Tabella delle ricette

Tampone e soluzione	ricetta	Commenti
10 X TBE	0,89 milioni di tampone Tris	pH dovrebbe essere impostato a 8.2 usando l'acido acetico
	0,89 M di acido borico
	30mM EDTA
Miscela di gel	15% acrilammide-bisacrilammide sol, 19:1	La miscela di gel non deve contenere cristalli di urea
	8M di urea
	1X TBE
Colorante a caricamento gel	0,05 % (p/v) blu di bromofenolo	Bisogna fare attenzione quando si maneggia la formammide deionizzata
	0,05 %(p/v) xilene xianolo
	100% formammide deionizzata
Etichettatura della sonda	Tampone PNK (10X, 2 μL)	Questa miscela contiene molecole radioattive, questo passaggio deve essere eseguito da personale addestrato all'interno di un laboratorio radioattivo
	Enzima PNK (1 μL)
	Oligo (100 μM, 0,1 μL)
	ƳP32 ATP (4 μL)
Wash Buffer - I	2X SSC
	0,5% (p/v) SDS
Wash Buffer - II	SSC 0,5X
	0,5% (p/v) SDS
Rimozione del buffer - I	SSC 0,5X
	0,1% (p/v) SDS
Buffer di Stripping - II	SSC 0,1X
	0,1% (p/v) SDS

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di acrilammide-bisacrilammide al 40%	sigma	Codice: A9926	chimico
Persolfato di ammonio (APS)	BioRad	Codice 1610700	chimico
carta assorbente	Whatman carta assorbente I	1001-125	Saggio
Blu di bromofenolo	sigma	B5525-5G	chimico
Punte di carico capillare	BioRad	2239915	Articoli in plastica
Formamide deionizzata	Ambion	AM9342	chimico
Blocco riscaldante	Eppendorf	Codice: 5350	dispositivo
Membrana Hybond N+nylon	Ge	RPN203B	Saggio
Bottiglia di ibridazione	sigma	Z374792-1EA	Articoli in plastica
Forno di ibridazione	Termo Scientifico	Codice 1211V79	dispositivo
N,N,N',N'- Tetrametiletilendiammina (TEMED)	sigma	T7024-25ml	chimico
Imager Fosforo	GE- Scanner per tifoni	29187194	dispositivo
Schermo e cassetta PhosphorImager	GE sanità	GE28-9564-75	dispositivo
Pipette	Gilson, modelli: P20 e P10	FA10002M, FA10003M	Articoli in plastica
Pipetta in plastica	Falcone	Codice 357550	Articoli in plastica
Apparecchio in gel di poliacrilammide	BioRad	Codice 1658003EDU	dispositivo
Colonna Sephadex G-25	GE sanità	27532501	dispositivo
Concentratore Speed Vac	Termo Scientifico	Codice 20-548-130	dispositivo
Spinwin	Tarsons	Anno 1010	dispositivo
Polinucleotide chinasi T4 (PNK)	Neb	Codice: M0201S	Saggio
Apparecchio Transblot	BioRad	1703946	dispositivo
Tampone di ibridazione ULTRAHyb	Ambion	AM8670	Saggio
urea	Fischer Scientific	Codice: 15985	chimico
Reticolante UV	UVP	CL-1000L	dispositivo
vortice	Tarsons	3020	dispositivo
Bagnomaria	NEOLAB	D-8810	dispositivo
Xilene cianolo	sigma	X4126-10G	Saggio