Biorilevamento a effetto di campo basato su biosensore di grafene per rilevare le interazioni proteina-proteina

Abstract

Fonte: Qvit, N., et al. Esplorazione dell'interazione biomolecolare tra il chaperone molecolare Hsp90 e la sua proteina chinasi client Cdc37 utilizzando la tecnologia di biorilevamento ad effetto di campo. J. Vis. Exp. (2022).

In questo video, descriviamo la tecnologia di biorilevamento ad effetto di campo (FEB) per rilevare e quantificare le interazioni proteina-proteina. Le proteine bersaglio immobilizzate sul biosensore di grafene interagiscono con le proteine dell'analita in soluzione, provocando alterazioni della corrente elettrica nel sistema FEB. Questo cambiamento nella risposta elettrica indica l'affinità di legame tra le proteine.

Protocollo

NOTA: Le proteine ricombinanti utilizzate in questo studio, Hsp90 e Cdc37, sono state ottenute commercialmente (vedi Tabella dei materiali).

1. Attivazione del chip

NOTA: Tutti i materiali da utilizzare nell'esperimento sono elencati nella Tabella dei Materiali. Filtrare tutte le soluzioni preparate attraverso un filtro sterile da 0,2 μm.

1. Preparare la soluzione di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC) aggiungendo 2 mg di EDC a 2,5 mL di tampone 1 M 2-(N-morfolino) acido etano solfonico (MES) (pH = 6,0) in una provetta d....

Risultati

Figura 1: Riepilogo del protocollo. (A) Riepilogo dei passaggi per il processo di attivazione del chip. (B) Rappresentazione grafica dei cinque passaggi ripetuti nel protocollo.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Software di analisi automatizzato	Software Agile plus, Cardea (Nanomed)	NA Numero CAS: NA	Nel testo viene indicato come il software di analisi automatizzata fornito con lo strumento. Genera analisi automatizzate.
COOH-BPU (unità di elaborazione del biorilevamento)	Software Agile plus, Cardea (Nanomed)	NA Numero CAS: NA	Chip biosensore
Software di revisione dei dati	Datalign 1.0, Cardea (Nanomed)	NA Numero CAS: NA	Indicato come il software di revisione dei dati fornito nel testo. Fornito con lo strumento e consente di rivedere ed esportare i punti dati informativi.
Sacca per dialisi	CelluSep, Prodotti per filtrazione a membrana	T2-10-15 Numero CAS: NA	Tubi T2 (6.000-8.000 MWCO), (10 mm fw, 6,4 mm Ø, 0,32 ml/cm, 15 m)
EDC (1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide)	Cardea (Nanomed)	EDC160322-02 Numero CAS: 25952-53-8	Polvere bianca
tampone MES (acido 2-(N-morfolino) etano solfonico)	Merck	M3671-50G Numero CAS: 4432-31-9	Polvere bianca
Chip NHS (N-idrossisulfosuccinimide)	Cardea (Nanomed)	NA Numero CAS: NA	Chip a base di grafene
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) X 10	Bio-Laboratorio	001623237500 Numero CAS: 7758-11-4	Soluzione liquida trasparente
pipetta	Termo Scientifico	11855231 Numero CAS: NA	Finnpipette F3 5-50 μL, giallo
Quench 1 (3,9 mM di amino-PEG5- di alcol in 1 X PBS)	Cardea (Nanomed)	0105-001-002-001 Numero CAS: NA	Soluzione liquida e trasparente
Estinguere 2 (1 M di etanolammina (pH=8,5))	Cardea (Nanomed)	0105-001-003-001 Numero CAS: NA	Soluzione liquida e trasparente
Proteina ricombinante Cdc37	Abcam	AB256157 Numero CAS: NA
Proteina ricombinante Hsp90 beta	Abcam	AB80033 Numero CAS: NA
foglio di calcolo	Excel, ufficio Microsoft	NA Numero CAS: NA
Software statistici	GraphPad, prisma	NA Numero CAS: NA	Indicato come l'altro software statistico. Possono essere utilizzati anche il grafico Sigma, il phyton o altri programmi statistici
Sulfo-NHS	Cardea (Nanomed)	NHS160321-07 Numero CAS: 106627-54-7	Polvere bianca
Suggerimenti	Alex rosso	LC 1093-800-000 Numero CAS: NA	Puntale 1-200 μl, sfuso, 1.000 pz