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NOTA: Le proteine ricombinanti utilizzate in questo studio, Hsp90 e Cdc37, sono state ottenute commercialmente (vedi Tabella dei materiali).
1. Attivazione del chip
NOTA: Tutti i materiali da utilizzare nell'esperimento sono elencati nella Tabella dei Materiali. Filtrare tutte le soluzioni preparate attraverso un filtro sterile da 0,2 μm.
- Preparare la soluzione di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC) aggiungendo 2 mg di EDC a 2,5 mL di tampone 1 M 2-(N-morfolino) acido etano solfonico (MES) (pH = 6,0) in una provetta da 15 mL. Preparare soluzioni di N-idrossisulfosuccinimide (sulfo-NHS) aggiungendo 6 mg di sulfo-NHS a 2,5 mL di tampone MES 1 M (pH = 6,0) in una provetta separata da 15 mL. Aliquotare 50 μL di ciascuna soluzione in provette indipendenti e conservare a -20 °C per un uso futuro.
- Miscelare volumi uguali di soluzione EDC e sulfo-NHS (50 μL di EDC + 50 μL di sulfo-NHS) pipettando verso l'alto e verso il basso (senza vortici).
NOTA: La soluzione miscelata di EDC/sulfo-NHS deve essere utilizzata entro 30 minuti per mantenere un'efficace reticolazione per una corretta funzionalizzazione del chip.
- Posizionare il chip del biosensore (5,7 cm x 2,4 cm; vedere la tabella dei materiali) fornito dall'azienda in una capsula di Petri di vetro con un coperchio montato. Si suggerisce che tutte le fasi di funzionalizzazione coinvolte nell'attivazione del chip vengano eseguite all'interno della capsula di Petri. Applicare 50 μl di tampone MES 1 M (pH = 6,0) sul chip del biosensore, incubare per 1 minuto a temperatura ambiente e quindi aspirare il tampone.
- Applicare immediatamente 50 μl di soluzione EDC/sulfo-NHS sul chip del sensore. Coprire la capsula di Petri e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione EDC/sulfo-NHS dal chip.
- Sciacquare il chip una volta con 50 μl di tampone MES 1 M (pH = 6,0); aspirare il tampone MES.
2. Immobilizzazione della proteina bersaglio
- Sciacquare il chip 2 volte con 50 μl di 1x PBS (pH = 7,4). Aspirare il PBS dal chip e aggiungere la molecola bersaglio, Hsp90 (50 μL; 500 nM).
NOTA: la mancata corrispondenza del buffer può rovinare l'intero esperimento; quindi, prima dell'esperimento, è importante assicurarsi che la molecola bersaglio si trovi nello stesso tampone utilizzato per la calibrazione (ad esempio, 1x PBS (pH = 7,4)). Se necessario, eseguire uno scambio di tampone mediante dialisi notturna prima dell'esperimento. In questo esperimento, la dialisi notturna è stata eseguita per entrambe le proteine ricombinanti, Hsp90 e Cdc37, contro 1x PBS (pH = 7,4; vedi Tabella dei materiali) con un adeguato scambio di tampone a 4 °C. La concentrazione del materiale bersaglio (Hsp90 in questo caso) può variare in base ai diversi protocolli sperimentali e alla natura dei materiali bersaglio (proteine/peptidi/ligandi).
- Coprire la capsula di Petri in vetro e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione contenente la molecola bersaglio e risciacquare 3 volte con 50 μl di 1x PBS (pH = 7,4). Aspirare la soluzione 1x PBS (pH = 7,4) dal chip.
- Aggiungere 50 μl di soluzione Quench 1 (3,9 mM di amino-PEG5-alcol in 1x PBS (pH = 7,4)) al chip. Coprire la capsula di Petri di vetro e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione Quench 1 dal chip.
- Aggiungere 50 μl di soluzione Quench 2 (1 M etanolammina (pH = 8,5)) al chip. Coprire la capsula di Petri in vetro e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione Quench 2 dal chip e sciacquare il chip 5 volte utilizzando 50 μl di 1x PBS, lasciando l'ultima gocciolina di PBS sul sensore.
3. Preparazione dei campioni di analita
- Preparare una serie di diluizioni dell'analita per Cdc37 nell'intervallo di concentrazione desiderato. Per il primo esperimento, sono state utilizzate le seguenti concentrazioni: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1.000 nM, 2.000 nM, 3.000 nM e 5.000 nM. Per il secondo esperimento, è stato utilizzato un diverso insieme di concentrazioni che vanno da 0,4 nM a 200 nM.
- Progettare l'esperimento in modo da includere almeno otto diverse concentrazioni di analita per ottenere un valore KD affidabile. Preparare le diverse diluizioni della proteina dell'analita nello stesso tampone utilizzato per la calibrazione e la proteina bersaglio; qui è 1x PBS (pH = 7,4).
4. Caricamento del chip biosensore attivato nel dispositivo FEB
NOTA: Il dispositivo FEB è costituito da un lettore dotato di indicazioni luminose a LED e da una cartuccia per inserire il chip biosensore.
- Dopo l'immobilizzazione della proteina bersaglio, inserire il chip attivato nella cartuccia del dispositivo, che è collegato tramite USB a un computer. Dopo l'inserimento del chip, sul lettore verrà visualizzata una luce LED verde che indica che il dispositivo FEB è pronto per l'esperimento. Installare il software automatizzato (vedi Tabella Materiali) fornito dall'azienda sul computer, a cui è collegato il dispositivo FEB, per monitorare l'esperimento passo dopo passo come descritto di seguito.
5. Esegui l'esperimento
- Premi il modulo Esegui esperimento sul software automatizzato e scegli 10 punti con rigenerazione o qualsiasi altro protocollo desiderato. Inserisci i seguenti dettagli: nome dell'operatore, nome dell'esperimento, data (ad esempio, Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); buffer di rigenerazione (ad esempio, buffer PBS); il bersaglio immobilizzato (ad esempio, Hsp90); analita in soluzione (ad esempio, Cdc37).
- Premere il pulsante Inizia l'esperimento visualizzato sul software e seguire le istruzioni mostrate dal software automatizzato come descritto di seguito.
nota: Il software è completamente automatizzato, facile da usare e guida l'utente durante l'esperimento passo dopo passo. Sullo schermo apparirà una finestra pop-up con le istruzioni per procedere ulteriormente in ogni fase dell'esperimento. Il software fornirà istruzioni per ogni passaggio ripetitivo consecutivamente dalla calibrazione, all'associazione dell'analita, alla dissociazione, alla rigenerazione e al lavaggio (5x) per ogni concentrazione di analita durante l'esperimento.
- Eseguire la calibrazione dello strumento. A tale scopo, aspirare la soluzione di PBS rimanente dal chip e applicare 50 μl di tampone di calibrazione (1x PBS; pH = 7,4). Premere il pulsante Continua e attendere 5 minuti fino al termine della fase di calibrazione. Il software visualizza il punto finale determinato per la fase di calibrazione (5 min) con un allarme di avviso da seguire.
- Quindi, eseguire un'associazione con l'analita. A tale scopo, aspirare il tampone di calibrazione dal chip e applicare 50 μl della concentrazione più bassa dell'analita (25 nM di Cdc37). Premere il pulsante Continua e attendere 5 minuti fino al termine della fase di associazione. Il software visualizza il punto finale per la fase di associazione (5 min) con un avviso di allarme per procedere.
- Eseguire una dissociazione dell'analita. A tal fine, aspirare la soluzione dell'analita dal chip e applicare 50 μl di tampone di dissociazione (1x PBS; pH = 7,4). Premere il pulsante Continua e attendere 5 minuti fino al termine della durata della fase di dissociazione (5 minuti). Il software visualizza il punto finale per la fase di dissociazione (5 min) con un allarme di avviso da seguire.
- Successivamente, eseguire la rigenerazione del truciolo. Aspirare la soluzione di dissociazione dal chip e applicare 50 μL di tampone di rigenerazione (1x PBS; pH = 7,4). Premere il pulsante Continua e attendere 30 s fino al termine della durata della fase di rigenerazione (30 s). Il software visualizza il punto finale per la fase di rigenerazione (30 s) con un allarme di avviso da seguire.
- Infine, lavate il chip. Aspirare la soluzione rigenerante dal truciolo e applicare 50 μL di tampone di lavaggio (1x PBS; pH = 7,4) sul truciolo. Aspirare la soluzione dal chip e ripetere l'operazione 5 volte. Lasciare l'ultima goccia di tampone di lavaggio sul chip e premere il pulsante Continua e attendere 30 s fino al termine della durata della fase di lavaggio sul display del software.
NOTA: Il software visualizza il punto finale per la fase di lavaggio (30 s) con un allarme di avviso per procedere con il ciclo successivo dell'esperimento.
- Ripetere i passaggi per ogni concentrazione dell'analita utilizzata; le cinque fasi di calibrazione, associazione dell'analita, dissociazione, rigenerazione e lavaggio (5x) costituiscono un ciclo. Per l'esperimento mostrato qui, abbiamo eseguito 10 cicli per 10 concentrazioni di analita (che vanno da 25 nM a 5.000 nM o da 0,4 nM a 200 nM; Figura 1).
