Tecniche di rilevazione delle interazioni biomolecolari

In questo video, descriviamo la tecnologia di biorilevamento ad effetto di campo (FEB) per rilevare e quantificare le interazioni proteina-proteina. Le proteine bersaglio immobilizzate sul biosensore di grafene interagiscono con le proteine dell'analita in soluzione, provocando alterazioni della corrente elettrica nel sistema FEB. Questo cambiamento nella risposta elettrica indica l'affinità di legame tra le proteine.

In questo video, dimostriamo l'uso della fotometria di massa per studiare le interazioni antigene-anticorpo in una camera di flusso. La luce focalizzata si diffonde in modo diverso in base alla massa delle molecole. Un rivelatore raccoglie la luce diffusa e genera il modello di interferenza sotto forma di punti di varia intensità, che si correlano con le masse molecolari.

Il video descrive la tecnica di imaging FLIM-FRET per determinare l'interazione proteina-proteina nei batteri vivi che esprimono proteine citoplasmatiche marcate con proteine fluorescenti, un eGFP donatore e l'accettore mCherry. La tecnica combinata consente anche la quantificazione delle proteine interagenti.

In questo video, dimostriamo la tecnica per misurare le interazioni transcellulari tra le molecole di adesione delle cellule sinaptiche attraverso il saggio di aggregazione cellulare HEK. In questo saggio, un numero uguale di cellule HEK che esprimono una molecola di adesione cellulare presinaptica desiderata e una proteina fluorescente vengono mescolate con cellule HEK che esprimono una molecola di adesione cellulare post-sinaptica e un'altra proteina fluorescente. L'interazione tra le...

Questo video descrive il saggio di legatura di prossimità per studiare le interazioni proteina-proteina in situ nelle cellule di nematodi. La stretta vicinanza delle proteine di interesse genera il modello circolare di DNA con l'aiuto di una sonda PLA attaccata a un anticorpo secondario. La sonda viene ulteriormente amplificata utilizzando la soluzione di amplificazione, che produce un lungo DNA a filamento singolo seguito dall'ibridazione della sonda del rivelatore, consentendo la...

Questo video mostra complessi proteici co-immunoprecipitati su una membrana PVDF per l'analisi dell'interazione proteina-proteina. Le proteine ridotte dei complessi sono state trattate con tripsina per scindere le singole proteine in corrispondenza dei peptidi più piccoli, quindi i peptidi rimanenti sono stati estratti dalla membrana in PVDF. Il peptide estratto derivato da entrambe le proteine del complesso è stato quindi essiccato e risospeso in una bassa concentrazione di acido formico per...

In questo video, dimostriamo la tecnologia dell'interferometria a biostrato (BLI) per rilevare le interazioni intermolecolari tra ligandi e analiti bersaglio in tempo reale. Il BLI misura i cambiamenti nel modello di interferenza della luce bianca riflessa da uno strato di ligandi immobilizzati sulla superficie di un biosensore mentre interagiscono con gli analiti in soluzione.

Questo video dimostra l'uso della spettroscopia di fluttuazione della fluorescenza per rilevare l'interazione tra le proteine della superficie cellulare ai contatti cellula-cellula. Esprimendo il recettore di adesione transmembrana di interesse marcato con una proteina fluorescente e mescolando due diverse popolazioni cellulari che ospitano due etichette fluorescenti spettralmente separate, la trans-interazione tra i recettori di due cellule vicine con fluorescenza di colore diverso viene...

In questo video, dimostriamo una tecnica per eseguire la co-immunoprecipitazione di proteine PD-1 wild-type e mutate marcate con GFP utilizzando perle rivestite con anticorpi anti-GFP. Le proteine PD-1-GFP legate al bead-bound sono incubate con proteine SHP2 che interagiscono con PD-1, consentendo l'identificazione di specifici motivi strutturali in PD-1 che svolgono un ruolo critico nell'interazione con SHP2.

Questo video descrive una tecnica basata su ELISA che rileva le interazioni proteina-proteina tra due proteine misurando il legame della seconda proteina alla prima proteina immobilizzata. La seconda proteina legata viene rilevata utilizzando anticorpi specifici marcati con un enzima, come la perossidasi di rafano.

Questo video mostra un test di biosensore conduttimetrico per studiare l'interazione di un anticorpo con un antigene bersaglio immobilizzato su un chip trasduttore. Il biosensore è progettato per avere una proteina chimerica bifunzionale, un enzima β-lattamasi con un sito catalitico funzionale fuso a un nanocorpo per legarsi all'antigene bersaglio immobilizzato. Dopo il legame, l'idrolisi catalitica di un substrato antibiotico da parte dell'enzima β-lattamasi genera un segnale elettrico,...

Questo video mostra una tecnica che utilizza peptidi biotinilati che penetrano nelle cellule per rilevare le interazioni intracellulari proteina-proteina. I peptidi che penetrano nelle cellule facilitano l'ingresso del peptide coniugato in una cellula e si legano specificamente alle sue proteine interagenti. La biotina, dopo essersi legata all'avidina, permette la purificazione del complesso proteico interagente da un lisato cellulare.

Questo video mostra il saggio a due ibridi di lievito per rilevare specifiche auto-interazioni proteiche. In questo saggio, la proteina di interesse è marcata in due domini di un fattore di trascrizione che codifica per l'enzima β-galattosidasi. Quando le due proteine interagiscono, ciò provoca la trascrizione e la traduzione per formare l'enzima, che viene poi rilevato utilizzando un saggio biochimico.

Questo video dimostra la purificazione di affinità tandem, una tecnica per purificare complessi proteici da cellule eucariotiche per studiare l'interazione proteina-proteina. Il complesso contiene due proteine marcate con diversi tag epitopici. Dopo la purificazione del complesso utilizzando due resine con un'affinità per i due diversi tag in modo sequenziale, la presenza di entrambe le proteine nell'eluito conferma l'interazione tra le due.

Questo video descrive la tecnica di risonanza plasmonica di superficie, o SPR, per studiare l'interazione tra due molecole utilizzando un chip sensore. La variazione dell'angolo di risonanza e l'intensità della luce riflessa vengono rilevate in funzione dell'associazione e della dissociazione di due molecole, e questo fornisce informazioni sulle interazioni tra le due molecole.

Questo video descrive la tecnica di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare per studiare le interazioni proteina-proteina tra 15proteine envoplakin wild-type e mutanti marcate con N e la proteina vimentina non marcata. L'interazione riuscita tra envoplakin wild-type e vimentina porta ad un esteso allargamento della linea e alla scomparsa dei picchi negli spettri NMR, mentre l'assenza di un'interazione tra l'envoplakin mutata e la vimentina si traduce in picchi ben risolti negli spettri...

In questo video, dimostriamo la tecnica di visualizzazione dei fagi per isolare proteine pre-ingegnerizzate che esprimono proteine con un'elevata affinità per la proteina bersaglio.

Questo video dimostra la tecnica della spettroscopia di fluttuazione della fluorescenza (FFS) per studiare l'omo-oligomerizzazione delle proteine. Le proteine marcate in fluorescenza in un campione vengono dimerizzate utilizzando un agente quando si studia l'oligomerizzazione proteica mediante FFS. Utilizzando un microscopio confocale, mentre le proteine si muovono dentro e fuori dal piccolo volume di osservazione, viene eseguita l'analisi delle fluttuazioni della luminosità delle molecole...

Questo video descrive BiFC-PALM - una combinazione di microscopia di localizzazione fotoattivata e complementazione a fluorescenza bimolecolare - per valutare le interazioni proteina-proteina. La BiFC prevede la fusione di due frammenti proteici fluorescenti con due proteine di interesse interagenti. Quando le due proteine interagiscono, i frammenti vengono portati in prossimità, il che consente alle due parti di unirsi e ricostituire una proteina fluorescente funzionale. La fluorescenza di un...

In questo video, descriviamo la tecnica dell'anisotropia a fluorescenza per studiare le interazioni tra la proteina della sindrome di Shwachman-diamond (SBDS) marcata con fluorofori e la 1 GTPasi simile al fattore di allungamento (EFL1). All'incubazione di proteine SBDS con concentrazioni gradualmente crescenti di EFL1, si osserva un costante aumento dell'anisotropia, indicando una riuscita interazione tra le due proteine.

In questo video, dimostriamo la tecnica di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare in-cell per studiare le interazioni proteina-ligando tra proteine sovraespresse non marcate e piccole molecole. Il successo dell'interazione ligando-proteina è confermato visivamente dalla comparsa di un ulteriore insieme di picchi nella regione spettrale di interesse che sostituisce gradualmente i picchi originali.

Questo video dimostra un metodo per studiare le interazioni proteina-farmaco utilizzando la biopanoramica basata su biosensore QCM della libreria di peptidi visualizzati dai fagi T7. La biopanazione di fagi che visualizzano un peptide specifico sul biosensore QCM consente l'isolamento specifico di peptidi ad alta affinità, seguito dal sequenziamento degli amminoacidi, che aiuta a identificare siti di interazione specifici sulla proteina bersaglio.

Questo video descrive SEC-MALS, che sfrutta le capacità della cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC) e della diffusione della luce multi-angolo (MALS). In SEC-MALS, il SEC separa le proteine o i complessi proteici in base alle loro dimensioni e il rivelatore MALS determina il peso molecolare medio misurando l'intensità della luce diffusa dalla molecola a diverse angolazioni.

In questo video, abbiamo dimostrato la purificazione dell'affinità di complementazione bimolecolare, BiCAP, per rilevare e isolare specifici dimeri proteici utilizzando anticorpi a dominio singolo specifici per la conformazione.

In questo video, descriviamo un saggio di legame competitivo basato sulla citometria a flusso per rilevare le interazioni tra il recettore delle chemochine CXC 4 (CXCR4) e il suo ligando naturale marcato in fluorescenza CXC Chemokine Ligand 12 (CXCL12), in presenza di una piccola molecola mirata a CXCR4. L'incubazione di cellule che esprimono CXCR4 con concentrazioni più basse di piccole molecole consente in una certa misura il legame CXCR4-CXCL12, che diminuisce progressivamente con un aumento...

Questo video dimostra il rilevamento basato sul test reporter dell'interazione recettore-ligando. L'interazione recettore-ligando attiva la via di segnalazione a valle, causando la generazione e il rilascio di citochine come molecole reporter secretorie nella soluzione, che viene confermata mediante ELISA.

In questo video, le sonde di forza a biomembrana (BFP) vengono utilizzate per misurare le forze tra recettori e ligandi. Questa tecnica è in grado di rilevare le interazioni monitorando la pressione necessaria per rompere i legami tra il pMHC coniugato sulle perle della sonda e i TCR sulle cellule bersaglio.

Questo video mostra un test di competizione per studiare i partner proteici leganti GTPasi. Utilizzando la proteina GTPasi legata ai nucleotidi immobilizzata su sfere magnetiche, il legame competitivo tra due partner proteici interagenti per lo stesso sito di legame sulla GTPasi può essere studiato per valutare le affinità di legame dei partner proteici.

In questo video, dimostriamo il processo per rilevare gli isotipi di anticorpi in più campioni di siero umano utilizzando un vetrino microarray stampato con sottotipi antigenici di ceppi di virus dell'influenza.

In questo video, dimostriamo il test di spostamento della mobilità elettroforetica per rilevare le interazioni proteina-DNA utilizzando sonde di DNA marcate con fluorescenza a infrarossi. Quando la proteina si lega alla sonda del DNA, forma un grande complesso che migra lentamente e appare come una banda spostata sul gel.

In questo video, dimostriamo la tecnica di immunoprecipitazione della cromatina per identificare i siti di legame delle proteine su regioni specifiche del DNA genomico delle cellule precursori degli oligodendrociti attraverso l'immunoprecipitazione selettiva di frammenti di cromatina legati alle proteine. Questo metodo aiuta a studiare l'interazione di diverse proteine regolatrici, compresi i fattori di trascrizione coinvolti nella regolazione genica.

Questo video descrive l'anisotropia di fluorescenza ad alte prestazioni che aiuta a monitorare l'interazione tra fattori di trascrizione e DNA. Il test monitora le interazioni di una molecola di DNA marcata con fluoroforo con il suo fattore di trascrizione specifico misurando il grado di polarizzazione dovuto alla rotazione molecolare o all'anisotropia del DNA marcato con fluoroforo.

Questo video mostra un test in vivo nei batteri per studiare l'interazione delle proteine leganti l'RNA (RBP) con l'RNA. Le cellule batteriche vengono trasformate con due costrutti plasmidici: un plasmide del sito di legame che codifica per un mRNA contenente un gene reporter fluorescente a valle di un sito di legame RBP, mentre un plasmide RBP esprime le proteine RBP sotto il controllo di un induttore. Dopo l'aumento della produzione di RBP mediato dall'induttore, le RBP si legano all'mRNA,...

In questo video, dimostriamo il test del lievito modificato one-hybrid, che rileva più proteine che interagiscono con il DNA bersaglio. Le cellule di lievito trasformate contengono la sequenza di DNA bersaglio a monte del gene reporter. Inoltre, esprimono proteine del fattore di trascrizione. Quando le proteine formano complessi e si legano al DNA bersaglio, il gene reporter viene espresso e può essere rilevato enzimaticamente.

In questo video, dimostriamo la procedura per determinare l'attività dell'elicasi di una proteina bersaglio per svolgere il substrato di dsRNA marcato con biotina. L'attività dell'enzima è stata identificata analizzando lo spostamento della mobilità elettroforetica, seguito da un saggio di chemiluminescenza utilizzando streptavidina coniugata con enzimi chemiluminescenti.

In questo video, descriviamo il metodo di immunofluorescenza per visualizzare la localizzazione delle proteine di riparazione del DNA γH2AX e 53BP1 nei siti di rotture del DNA a doppio filamento nei nuclei cellulari irradiati.

Questo video mostra un test di pull-down dell'RNA in vitro per identificare le proteine leganti l'RNA (RBP), che interagiscono con le sequenze di elementi ricchi di adenilato-uridilato (ARE) nell'mRNA. Le RBP bersaglio di un lisato cellulare vengono mescolate con una sonda di RNA per formare complessi RNA-proteina. I complessi vengono isolati mediante purificazione per affinità utilizzando l'affinità dell'etichetta della destiobiotina della sonda a RNA per una microsfera magnetica marcata con...

In questo video, descriviamo l'evoluzione sistematica dei ligandi con il metodo dell'arricchimento esponenziale (SELEX) per identificare specifiche sequenze leganti l'RNA per una proteina bersaglio di interesse. La proteina viene incubata con un ampio pool di sequenze di RNA randomizzate e le sequenze di RNA leganti la proteina vengono isolate, amplificate con PCR e sequenziate per identificare i loro siti di legame proteico.

Questo video descrive un metodo per visualizzare l'assemblaggio di condensati di proteine di fusione su molecole di DNA in loci specifici utilizzando l'imaging a singola molecola. Questi condensati si formano a causa delle interazioni LCD-LCD e LCD-DBD, che consentono il reclutamento della RNA polimerasi II e una migliore trascrizione genica.

Questo video dimostra la calorimetria differenziale a scansione, una tecnica per studiare l'interazione tra una biomolecola e un ligando. Il legame di un aptamero di DNA e di un ligando termolabile viene studiato applicando ripetuti cicli di riscaldamento e raffreddamento al campione e ottenendo scansioni per l'analisi termodinamica.

Questo video dimostra la termoforesi su microscala per studiare l'interazione proteina-lipide. Il test rileva l'interazione tra le molecole quantificando il movimento termoforetico delle proteine marcate con fluorescenza in risposta a un gradiente di temperatura. La molecola fluorescente viene miscelata con diverse concentrazioni di molecole lipidiche non fluorescenti e la miscela di molecole nella soluzione viene caricata nei capillari. Un gradiente di temperatura viene applicato ai campioni...

In questo video, dimostriamo l'interazione tra proteine e vescicole fosfolipidiche artificiali utilizzando la citometria a flusso quantitativa. Il legame delle proteine marcate con fluorescenza alle vescicole fosfolipidiche marcate con fluorescenza aumenta l'intensità media della fluorescenza, e questo aumento viene rilevato da un citometro a flusso.

Questo video mostra una tecnica di microgravimetria dissipativa per studiare il legame delle proteine ai doppi strati lipidici. Piccole vescicole unilamellari vengono aggiunte per rivestire la superficie del sensore al quarzo di una microbiana. Utilizzando il legame io-dipendente dello ione calcio della proteina legante i fosfolipidi bersaglio al doppio strato, le variazioni della frequenza di oscillazione del sensore e la dissipazione dell'oscillazione vengono monitorate per determinare la...

In questo video, dimostriamo le interazioni proteina-fosfoinositide in un modello microfluidico utilizzando il saggio di modulazione del pH, utilizzando un colorante fluorescente sensibile al pH etichettato con il lipide fosfatidiletanolammina di un doppio strato lipidico supportato, chiamato piattaforma microfluidica. Le modulazioni del pH dopo il legame delle proteine con i fosfolipidi causano l'estinzione della fluorescenza.