1. Prepara le camere di flusso
- Pulire i vetrini coprioggetti
- Utilizzando flaconi di lavaggio con acqua distillata, etanolo e isopropanolo, sciacquare i vetrini coprioggetti da 24 mm x 50 mm nel seguente ordine: acqua, etanolo, acqua, isopropanolo, acqua. Asciugare i vetrini coprioggetti con un getto di azoto pulito. È importante sciacquare i vetrini coprioggetti dall'alto verso il basso, tenendo l'angolo inferiore con una pinza a punta morbida. Asciugare il vetrino coprioggetti nella stessa direzione per evitare il trasferimento di contaminanti dalla pinza (Figura 1A).
- Allo stesso modo, sciacquare i vetrini coprioggetti da 24 mm x 24 mm con acqua distillata, etanolo e acqua distillata. Asciugare i vetrini coprioggetti con un getto di azoto pulito.
- Identificare il lato di lavoro del vetrino coprioggetti, posizionare una goccia di acqua distillata sulla superficie del vetrino coprioggetti pulito e seguire i passaggi 3.1-3.2 del protocollo. Di solito, solo un lato del vetrino coprioggetti da 24 mm x 50 mm ha la qualità ottica adatta per le misurazioni MP.
nota: Dopo la messa a fuoco, non devono essere rilevabili imperfezioni significative della superficie e il valore del "segnale" mostrato nel software di raccolta dati deve essere inferiore allo 0,05% (Figura 2A-C). I lati di lavoro di tutti i vetrini coprioggetti nella scatola sono orientati nella stessa direzione. La stessa procedura dovrebbe essere utilizzata per testare l'efficienza della pulizia del vetrino coprioggetti.
- Assembla la camera di flusso
- Posizionare il vetrino coprioggetti da 24 mm x 24 mm su un foglio di alluminio. Posizionare delle strisce di nastro biadesivo sopra il vetrino coprioggetti da 24 mm x 24 mm come mostrato nella Figura 1B e tagliare il nastro lungo il bordo del vetro. Separare il vetrino coprioggetti dal foglio di alluminio e fissarlo al lato di lavoro del vetrino coprioggetti da 24 mm x 50 mm (Figura 1C).
nota: Le dimensioni del canale possono variare, ma si consiglia una larghezza di 3 mm-5 mm. I canali più larghi richiedono volumi di campione maggiori e i canali molto stretti possono essere difficili da caricare. Di solito, è possibile creare facilmente due canali paralleli sul vetrino coprioggetti da 24 mm x 24 mm. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
2. Prepara i campioni di anticorpo-antigene per le misurazioni di affinità
- Filtrare almeno 2 mL di tampone PBS utilizzando filtri per siringa da 0,22 μm per rimuovere particelle di polvere o aggregati. Centrifugare il brodo proteico per 10 minuti alla velocità massima della centrifuga da tavolo (circa 16.000 x g).
nota: PBS è il tampone raccomandato per questo protocollo, ma MP non ha particolari requisiti di tampone e sono accettabili anche altri tamponi biologici. Tuttavia, alte concentrazioni di glicerolo (>10%) e forze ioniche molto basse (concentrazione di sale <10 mM) possono influire sulla qualità dell'immagine e dei dati e non sono raccomandate.
- Determinare le concentrazioni effettive delle scorte di anticorpi e antigeni misurando la loro assorbanza UV di 280 nm.
- Calcolare le concentrazioni misurate della miscela antigene-anticorpo. Se il valore stimato dell'affinità di legame degli anticorpi non è noto, pianificare la preparazione di un campione con una concentrazione di antigene di 30 nM e di anticorpi di 20 nM. Quando l'affinità approssimativa è nota, il rapporto anticorpo/antigene e le loro concentrazioni devono essere ottimizzati in base ai valori Kd attesi. Utilizzare la concentrazione totale di antigene nella miscela pari alla somma del Kd atteso e della concentrazione totale di anticorpi nell'equazione seguente. Assumendo Kd1 = Kd2 per i due paratopi dell'anticorpo, ciò si tradurrà in concentrazioni comparabili dell'anticorpo libero e dei complessi anticorpo-antigene nel campione><.
Regolare la concentrazione di anticorpi per mantenere la concentrazione proteica totale nel campione entro l'intervallo di 10 nM e 50 nM. I migliori risultati si ottengono utilizzando miscele con concentrazioni di anticorpi comprese tra 5 nM e 25 nM.
nota: MP rileva proteine con una massa molecolare superiore a 40 kDa. Di conseguenza, le concentrazioni di campioni di antigeni con una massa molecolare inferiore a 40 kDa possono superare il limite tipico di 50 nM. Tuttavia, a concentrazioni superiori a circa 100 nM, anche gli antigeni a bassa massa molecolare potrebbero influenzare la qualità dell'immagine e l'accuratezza della determinazione del Kd.
- Preparare 50 μl della miscela anticorpo-antigene alla concentrazione di misurazione finale calcolata al punto 2.3.
nota: Per la determinazione del Kd è necessario un solo campione della miscela antigene-anticorpo. Tuttavia, la preparazione di diversi campioni con diversi rapporti antigene/anticorpo può aiutare a ottimizzare la concentrazione del campione. Se vengono raccolti dati da più campioni, questi possono essere analizzati tramite un adattamento globale.
- Incubare la/e miscela/e antigene-antigene/i per circa 10 minuti a temperatura ambiente per consentire alla reazione di legame di raggiungere l'equilibrio chimico. Evitare tempi di incubazione inutilmente lunghi.
nota: Il tempo di incubazione può variare a seconda della cinetica di legame. Per confermare che l'equilibrio chimico è stato raggiunto, le misurazioni del campione possono essere ripetute in diversi momenti di incubazione. I valori di Kd invarianti nel tempo indicano un'incubazione sufficientemente lunga. L'incubazione prolungata può portare a un significativo adsorbimento delle proteine sulla superficie del materiale da laboratorio in plastica e, di conseguenza, a errori significativi nella determinazione della concentrazione proteica. Per questo motivo, per la preparazione di campioni MP si consiglia vivamente di utilizzare strumenti da laboratorio a bassa aderenza.
3. Raccogli i dati della fotometria di massa
- Applicare una goccia di olio da immersione per microscopio sull'obiettivo dello strumento MP e posizionare la camera di flusso assemblata sul tavolino del microscopio. Assicurarsi che l'olio copra lo spazio tra il vetrino coprioggetti e l'obiettivo.
- Caricare la camera di flusso e mettere a fuoco il fotometro di massa.
- Depositare 10 μl di una soluzione tampone pulita e filtrata a un'estremità del canale della camera di flusso preparato nella fase 1. Il liquido entrerà nel canale per azione capillare.
- Regolare la posizione Z del tavolino per mettere a fuoco il microscopio sulla superficie di lavoro del vetrino coprioggetti da 24 x 50 mm.
- Nella scheda Controllo messa a fuoco del software di raccolta dati, utilizzare i pulsanti Su e Giù per effettuare le regolazioni iniziali con i pulsanti Su e Giù per il movimento del palcoscenico.
- Fare clic sul pulsante Nitidezza per visualizzare la lettura del segnale di nitidezza e utilizzare i pulsanti di regolazione fine Su e Giù per massimizzare il valore di Nitidezza.
- Fare clic sui pulsanti Imposta messa a fuoco e Blocca messa a fuoco per attivare la funzione di tracciamento della messa a fuoco. Un'immagine correttamente messa a fuoco (Figura 2A, C) dovrebbe avere un valore di "segnale" inferiore allo 0,05%.
nota: Se il valore del "segnale" nella posizione di massima nitidezza è superiore allo 0,05%, ciò può indicare impurità sulla superficie del vetro o nel tampone.
- Utilizzando lo stesso canale, caricare 20 μl del campione di anticorpo-antigene depositandolo su un lato del canale e tamponando il liquido dall'altra estremità con un piccolo pezzo di carta assorbente (Figura 1D).
nota: Il volume di un canale largo 3-5 mm è di circa 10 μl. Si consiglia di utilizzare il volume di campione aggiuntivo per sostituire completamente il tampone presente nel canale ed evitare la diluizione del campione.
- Dopo aver caricato il campione, fare immediatamente clic sul pulsante Registra per avviare la raccolta dei dati, acquisendo un video di 100 s (Figura 2D).
- Al termine della raccolta dei dati, immettere il nome del file e fare clic su OK per salvare il file di dati.
- Scartare i vetrini coprioggetti e pulire l'olio dalla lente dell'obiettivo con tamponi ottici di cotone imbevuti di isopropanolo.
nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
4. Analizza i dati MP
- Elaborare il file video raccolto utilizzando il software di elaborazione dati MP per identificare gli eventi di atterraggio.
- Utilizzare l'opzione di menu File/Apri per caricare il file per l'analisi e fare clic su Analizza.
- Fare clic sul pulsante Carica per caricare la funzione di calibrazione e salvare i dati analizzati utilizzando l'opzione di menu File/Salva risultati con nome.
- Adattare la distribuzione di massa molecolare con le funzioni gaussiane per ottenere le concentrazioni relative di ciascuna specie nel campione. Questa analisi può essere eseguita utilizzando un comune software di grafica scientifica (vedi Tabella dei materiali).
- Importare il file "eventsFitted.csv" nel software e tracciare la distribuzione della massa molecolare (colonna M nel file .csv) utilizzando la funzione Traccia/Statistiche/Istogramma.
- Fare doppio clic sull'istogramma per aprire la finestra Proprietà grafico. Disabilita il binning automatico e seleziona una dimensione del contenitore di 2,5 kDa. Fare clic sui pulsanti Applica e Vai per creare i dati Centri collocazione e Conteggi.
- Selezionare le colonne Centri contenitori e Conteggi e utilizzare la funzione di menu Analisi/Picchi e Baseline/Adattamento picchi multipli per adattare l'istogramma con le funzioni gaussiane. Fare doppio clic per indicare le posizioni approssimative dei picchi sul grafico di distribuzione, quindi fare clic sul pulsante Apri NLFit.
- Selezionare le caselle di controllo Fisso per i centri di picco "xc" e impostare i loro valori sulle masse molecolari previste dell'anticorpo libero e dei complessi antigene-anticorpo singolo e doppio. Seleziona l'opzione Condividi per i parametri di larghezza. Fare clic sul pulsante Adatta. I valori di altezza di picco adattati delle componenti gaussiane rappresentano la concentrazione relativa di ciascuna specie nel campione.
nota: Le dimensioni del contenitore possono essere regolate per ottimizzare la risoluzione del grafico di distribuzione di massa. Il limite di precisione MP è di circa 1 kDa, e le dimensioni dei contenitori più piccole potrebbero amplificare il rumore della distribuzione, senza rivelare alcuna informazione aggiuntiva. Contenitori di dimensioni molto grandi oscureranno i dettagli fini delle distribuzioni di massa.
- Calcola la frazione di concentrazione di ciascuna specie utilizzando la seguente equazione:
dove i valori hi e fi rappresentano rispettivamente le altezze di picco e le frazioni di concentrazione dell'anticorpo libero e dell'anticorpo a singolo e doppio legame nel campione.
