$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Preparazione del tampone di agarosio (Figura 1)
- Posizionare un vetrino da microscopio su una superficie piana e orizzontale. Disporre due vetrini sormontati da due strati di nastro adesivo su ciascun lato del vetrino iniziale.
nota: Mantenere uno spazio di 1-2 mm tra i tre vetrini allineati per evitare che l'agarosio fuso si diffonda sui vetrini con del nastro adesivo.
- Pipettare e versare una goccia di 70 μl di agarosio fuso all'1% sul vetrino. Aggiungere un quarto vetrino sulla parte superiore per appiattire la gocciolina di agarosio e premere delicatamente. Attendi circa un minuto.
- Togliere il vetrino superiore e far cadere con una pipetta circa 3 μL di batteri in 3 o 4 punti in punti diversi sul tampone di agarosio.
- Coprire con un vetrino coprioggetti per microscopia (ad esempio uno spessore 22x22 mm #1.5).
nota: La planarità e lo spessore dei vetrini coprioggetti sono importanti per lavorare con eccitazioni a due fotoni. I vetrini coprioggetti di precisione con planarità uniforme controllata e bassa autofluorescenza sono solitamente una buona scelta.
- Fissare il vetrino coprioggetti con paraffina fusa per sigillare il vetrino sul vetrino. Inizia fissando i quattro angoli del vetrino coprioggetti.
2. Imaging con una configurazione di microscopia a due fotoni
NOTA: Stiamo utilizzando un microscopio invertito a scansione di eccitazione a due fotoni fatto in casa con un obiettivo a immersione in acqua 60x 1.2NA che opera in modalità di raccolta a fluorescenza de-scansionata. La lunghezza d'onda di eccitazione a due fotoni è impostata a 930 nm. È fornito da un laser Ti:Zaffiro (frequenza di ripetizione di 80 MHz, ≈ larghezza di impulso di 70 fs) che lavora a 10-20 mW. I fotoni di fluorescenza sono stati raccolti attraverso un filtro passa-corto da 680 nm e un filtro passa-banda da 525/50 nm prima di essere diretti a un fotodiodo a valanga accoppiato in fibra collegato a un modulo di conteggio di singoli fotoni correlato nel tempo (TCSPC). Il microscopio è inoltre dotato di una lampada a fluorescenza a trasmissione. Diversi microscopi FLIM-FRET sono ora disponibili in commercio e molte strutture di imaging sono dotate di configurazioni in grado di eseguire misure FLIM-FRET.
- Utilizzare la lampada a fluorescenza per focalizzare l'obiettivo sul monostrato di batteri nel campione e selezionare le regioni di interesse.
- Verificare che l'otturatore del laser di eccitazione sia chiuso e che la luce infrarossa proveniente dal laser sia bloccata e non entri nel microscopio.
cautela: Prestare particolare attenzione e vigilanza costante lavorando con i laser a impulsi IR poiché la luce laser non può essere vista dagli occhi, ma qualsiasi esposizione diretta o riflessione laser anche transitoria può essere estremamente dannosa e creare danni irreversibili agli occhi. Fare riferimento alle procedure di sicurezza laser locali e alla formazione prima di utilizzare le configurazioni di microscopia.
- Posizionare il vetrino per microscopia sul tavolino con i vetrini coprioggetti rivolti verso l'obiettivo.
- Verificare che la lampada a fluorescenza sia accesa.
- Ruotare la torretta del cubo del filtro per selezionare il cubo eGFP e aprire l'otturatore della lampada a fluorescenza.
- Invia la luce di fluorescenza verso l'oculare del microscopio.
Attenzione: Assicurarsi che i filtri appropriati siano smaltiti nel percorso della luce per scartare la luce di eccitazione diretta proveniente dalla lampada a fluorescenza che può danneggiare gli occhi.
- Focalizzare l'obiettivo sui batteri utilizzando la manopola del microscopio.
- Selezionare una regione di interesse nel campione traslandola utilizzando il joystick che controlla il tavolino motorizzato
nota: La messa a fuoco è più facile con campioni altamente fluorescenti che consentono di vedere la fluorescenza direttamente con gli occhi.
- Commutare l'eccitazione per il laser 2PE per le misure FLIM-FRET.
- Inviare il percorso di emissione della fluorescenza verso il rivelatore.
- Ruotare indietro la torretta del cubo del filtro per selezionare il cubo dicroico per il laser a 930 nm.
- Impostare la potenza del laser su 20 mW.
- Impostare la dimensione della regione di interesse su 30 μm. Questa operazione regola la tensione che aziona i galvo-specchi e definisce l'intervallo dei loro movimenti (Figura 2).
- Accendere il rivelatore e avviare la scansione del campione: i pulsanti di avvio e arresto che controllano la scansione controllano anche l'apertura e la chiusura dell'otturatore laser sia per motivi di sicurezza che per limitare il fotobleaching del campione (Figura 2).
- Se necessario, regolare la messa a fuoco spostando leggermente la manopola di messa a fuoco fine del microscopio.
- Scegli il campo visivo per l'imaging spostando finemente il tavolino dall'interfaccia del computer. Questo può essere fatto sulla configurazione spostando la croce sull'immagine nel software di controllo del microscopio (Figura 2) che definirà il nuovo centro dell'immagine e premendo "Move Stage". Un buon campo visivo per l'acquisizione corrisponde a un'immagine con 10-30 batteri immobili, tutti correttamente focalizzati (tutti i batteri sono sullo stesso piano). Se sei interessato all'estrazione di dati FLIM-FRET su singole cellule, assicurati che i batteri siano ben individualizzati (la segmentazione delle immagini sarà molto più semplice).
