Saggio di aggregazione cellulare per rilevare le interazioni trans tra le molecole di adesione cellulare

Abstract

Fonte: Restrepo, S., et al., Misurazione delle interazioni transcellulari attraverso l'aggregazione proteica in un sistema cellulare eterologo. J. Vis. Exp. (2020)

In questo video, dimostriamo la tecnica per misurare le interazioni transcellulari tra le molecole di adesione delle cellule sinaptiche attraverso il saggio di aggregazione cellulare HEK. In questo saggio, un numero uguale di cellule HEK che esprimono una molecola di adesione cellulare presinaptica desiderata e una proteina fluorescente vengono mescolate con cellule HEK che esprimono una molecola di adesione cellulare post-sinaptica e un'altra proteina fluorescente. L'interazione tra le molecole di adesione cellulare costringe le cellule ad aggregarsi, che può essere misurata mediante microscopia a fluorescenza.

Protocol

1. Coltura cellulare e trasfezione

1. Produci terreni cellulari HEK con DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) integrato con 4,5 g/L di glucosio, L-glutammina e piruvato di sodio e il 10% di FBS. Filtro sterile.
2. Predeterminare i ligandi e i recettori adatti per il saggio di aggregazione.
   nota: In questo studio sono stati utilizzati Neurexin3α SS4+/- e uno dei suoi ligandi noti, LRRTM2. I ligandi e i recettori di interesse sono stati espressi dai cDNA in pcDNA3.1. Un assemblaggio Gibson è stato utilizzato per inserire Neurexin3α in pcDNA3.1. Neurexin3α F/R:
   TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
   GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.
3. Preparare HEK293T cellule.
   1. Coltiva HEK293T cellule fino a confluire in un pallone T-75.
   2. Una volta confluente, utilizzare 2 mL di tripsina e metterli in un'incubatrice a 37 °C per 2 minuti. Aggiungere 6 mL di terreno HEK al pallone per risospendere le cellule e trasferire tutti gli 8 mL in una provetta conica da 15 mL.
   3. Pellettare a 500 x g per 5 min e risospendere in terreno cellulare HEK per un totale di 8 mL.
   4. Contare le celle e aggiungere 735.000 cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Regolare il volume finale a 2 mL per ciascun pozzetto utilizzando terreni cellulari HEK.
   5. Mettere in un incubatore a 37 °C e lasciare che le cellule crescano per una notte o fino a quando non raggiungono il 50-60% di confluenza.
4. Trasfettare HEK293T cellule utilizzando il metodo del fosfato di calcio.
   1. Trasfettare il pozzo-1 con 3 μg della proteina di interesse e co-trasfettare con 1 μg di proteina fluorescente (3 μg di pcDNA3.1-Neurexin3α^WT SS4- e 1 μg di mCherry).
   2. Trasfettare well-2 come al punto 1.4.1. ma con la proteina mutata di interesse (pcDNA3.1-Neurexin3α^A687T SS4-).
   3. Trasfettare il pozzetto-3 con 3 μg del ligando di interesse e co-trasfettare con 1 μg di un'altra proteina fluorescente (3 μg di pcDNA3.1 LRRTM2 e 1 μg di GFP).
   4. Trasfettare il pozzetto-4 e il pozzetto-5 per fungere da controlli negativi: pozzetto-4 con 1 μg di GFP e pozzetto-5 con 1 μg di mCherry.
   5. Preparare un'altra piastra (come nei passaggi 1.4.1-1.4.4) se sono necessarie condizioni o controlli aggiuntivi (Neurexin3α,^WT/A687T, SS4+).
      nota: L'efficienza della trasfezione viene analizzata 24 ore dopo la trasfezione al microscopio a epifluorescenza e quantificata come il numero di cellule che esprimono la proteina fluorescente con cui sono state trasfettate. Un approccio più snello includerebbe la trasfezione di cellule HEK con un vettore bicistronico che codifica per una proteina fluorescente e il ligando di interesse ed è altamente raccomandato rispetto alla co-trasfezione. Nel caso di questo studio, le alfa neurexine sono ~4,3 kb e una bassa intensità di fluorescenza è stata osservata utilizzando un sistema bicistronico che richiede la co-trasfezione.
5. 48 ore dopo la trasfezione, raccogliere le cellule per l'aggregazione.
   1. Lavare ogni pozzetto due volte con PBS.
   2. Aggiungere 1 mL di EDTA 10 mM in PBS in ciascun pozzetto per dissociare delicatamente le interazioni cellula-cellula e incubare la piastra a 37 °C per 5 min.
      nota: La tripsina non è raccomandata per la fase 1.5.b a causa della potenziale scissione proteolitica delle molecole di adesione nello studio. Inoltre, dopo l'aggiunta di EDTA, il protocollo potrebbe non essere interrotto fino al completamento, poiché le cellule saranno ora esposte alle condizioni ambientali.
   3. Picchiettare delicatamente la piastra per staccare le cellule e raccogliere ciascun pozzetto in provette coniche separate da 15 ml.
   4. Centrifugare le provette coniche a 500 x g e a temperatura ambiente per 5 min.
6. Mentre le cellule vengono pellettate, preparare 6 provette di incubazione etichettando la parte superiore di ciascuna provetta per microcentrifuga con ogni condizione.
   nota: Ogni permutazione delle condizioni GFP e mCherry deve essere utilizzata per comprendere tutte le condizioni sperimentali e i controlli adeguati. Ad esempio: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3α^WT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3α^WT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. Realizzare tubi aggiuntivi per adattarsi a ulteriori condizioni e controlli.
7. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 500 μL di terreno HEK con 10 mM di CaCl₂ e 10 mM di MgCl₂ riscaldati a 37 °C.
   nota: L'aggiunta di CaCl₂ e MgCl₂ consente alle molecole di adesione di ristabilire il legame ed è richiesta solo se i partner di interazione transcellulare in questione richiedono cationi bivalenti per l'adesione.
8. Contare le cellule in ciascuna provetta conica da 15 mL utilizzando un emocitometro e aliquotare 200.000 cellule di ciascuna condizione in una provetta appropriata dal passaggio 1.6 per una miscela 1:1 in un volume totale di 500 μL.
   nota: Dovrebbero essere necessari solo 5 minuti per condizione per contare e aliquotare gli importi.
9. Incubare le provette a temperatura ambiente in un rotatore lento delle provette.

2. Acquisizione di immagini

1. Ottimizza i parametri di acquisizione del microscopio per campioni specifici. In questo esempio, le immagini sono state scattate con un microscopio a campo largo. Utilizzare un obiettivo aereo 5x (NA: 0,15; WD: 20000 μm) per ottenere un campo sufficientemente ampio per l'analisi.
2. Valutare l'aggregazione basale immediatamente dopo aver mescolato le due condizioni delle cellule HEK nel passaggio 1.8. Queste sono ora le immagini del "tempo zero".
   1. Pipettare 40 μl di ciascuna miscela di campioni su un vetrino da microscopio carico e visualizzare l'immagine in fluorescenza in entrambi i canali 488 e 561.
   2. Acquisisci tre diversi campi visivi su un piano di messa a fuoco per goccia di campione.
3. Acquisire le immagini finali a 60 minuti come immagine "tempo 60".
   1. Per ottenere l'immagine "tempo 60" della miscela dopo un'incubazione di 60 minuti, prelevare un altro campione da 40 μl di ciascuna condizione da provette rotanti e pipettare ciascun campione su un vetrino carico. Immagine come al passaggio 2.2.
      nota: L'aggregazione cellulare deve essere controllata ogni 15 minuti fino a quando non si verifica la saturazione. I tempi di aggregazione dipenderanno dalle proteine testate.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microprovette monouso da 5 mL con tappi a scatto	VWR	Codice 89000-028	Incubazione di una popolazione mista di cellule HEK
Unità filtrante a flusso rapido da 1000 mL, membrana aPES da 0,2 um	Thermo Fisher	567-0020	Sterilizzazione di terreni HEK
Provette da centrifuga SpectraTube da 15 mL	La scienza di Ward	Codice 470224-998	Raccolta di cellule HEK
Piastre sterili per coltura tissutale a 6 pozzetti	VWR	Codice 100062-892	Coltura di cellule HEK
cloruro di calcio	sigma	Codice 223506-500G	Trasfezione del fosfato di calcio, risospensione cellulare HEK
Centrifuga - Sorvall Legend RT	Prodotti da laboratorio Kendro	75004377	Raccolta di cellule HEK
incubatore cellulare di CO2	Termo Scientifico	HERACELL 150i	Incubazione delle cellule HEK durante la crescita
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) con 4,5 g/L di glucosio, L-glutammina e piruvato di sodio	Corning	10-013-CV	Manutenzione delle celle HEK
PBS salino tamponato con fosfato di Dulbecco (1X)	Gibco	Codice 14190-144	Passaggio/raccolta di celle HEK
Acido etilendiamminatetraacetico	sigma	ED-500G	Raccolta di cellule HEK
Fiasche di coltura ventilate Falcon, area di crescita 75cm2	Corning	9381M26	Coltura di cellule HEK
Siero fetale bovino	sigma	Codice 17L184	Manutenzione delle celle HEK
HEK293T celle	ATCC		Sistema di modelli
ImmagineJ	Nih	V: 2.0.0-rc-69/1.52p	Analisi delle immagini
Cloruro di magnesio esaidrato	sigma	Codice: M9272-500G	Risospensione cellulare HEK
Fosfato di sodio bibasico anidro	Fisher BioReagenti	BP332-500	Trasfezione del fosfato di calcio
Soluzione di tripsina 0,25% (1X)	GE Healthcare Scienze della vita	SH30042.01	Celle HEK passanti
Rotatore per tubi			Incubazione di una popolazione mista di cellule HEK
Vetrini per microscopio UltraClear. Bianco satinato, carica positiva	Denville Scientific Inc.	M1021	Acquisizione delle immagini
Microscopio a campo largo	Zeiss	Axio Vert 200M	Acquisizione delle immagini