NOTA: Questo protocollo utilizza ceppi di C. elegans in cui vengono entrambi etichettati potenziali partner interagenti. Si raccomanda vivamente di utilizzare un ceppo di controllo negativo, in cui non ci si aspetta che una proteina marcata interagisca con un altro partner di interazione candidato marcato. In questo caso, la GFP da sola è stata utilizzata come controllo negativo per valutare il background, poiché non ci si aspetta che il DLC-1 interagisca con la GFP nel worm. OMA-1 marcato con GFP è stato utilizzato come ceppo sperimentale, poiché i dati preliminari suggeriscono un'interazione con DLC-1. I ceppi di nematodi che co-esprimono proteine di controllo e di test con DLC-1 marcato 3xFLAG sono indicati in questo testo come 3xFLAG::D LC-1; GFP e 3xFLAG::D LC-1; OMA-1::GFP (ceppi disponibili su richiesta; maggiori informazioni nella Tabella dei Materiali), rispettivamente. Qui vengono utilizzati i tag 3xFLAG e GFP; tuttavia, altri tag possono essere sostituiti purché i loro anticorpi siano compatibili con i reagenti del kit PLA.
1. Cura degli animali
- Tenere i vermi su piastre di terreno di crescita per nematodi (NGM) seminate con il ceppo OP50 di E. coli e mantenerli a 24 °C per un'espressione ottimale della GFP.
- Passaggio vermi adulti ogni 2-3 giorni per propagare i vermi e mantenerli ben nutriti.
2. Preparazione della cultura sincrona
- Sincronizza i vermi sbiancando una piastra di ermafroditi gravidi ben nutriti. Un protocollo di sbiancamento è descritto in Porta-de-la-Riva et al. Lasciare schiudere gli embrioni per una notte in una provetta da centrifuga a 24 °C mentre ruotano da un capo all'altro in 10 mL di tampone M9 con terreno minimo (M9). Ciò produrrà una coltura di larve L1 arrestate.
- Incubare il tubo di larve arrestate allo stadio L1 su ghiaccio per 10 minuti, quindi rabboccare il tubo con 1x M9 ghiacciato.
- Utilizzare una centrifuga per pellettare le larve a 600 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare con cura il surnatante in modo che rimangano solo 1-2 ml di surnatante.
- Risospendere il pellet di larve e utilizzare una micropipetta per trasferire 2 μL di coltura di larve sospese su un vetrino. Conta quante larve sono presenti per determinare la densità della coltura delle larve, che aiuterà a guidare la semina dei vermi nel passaggio 2.5.
nota: Una densità di 10-15 larve L1/1 μL funziona bene per la semina.
- Utilizzare una micropipetta per trasferire il volume di coltura delle larve necessario per seminare circa 100-120 larve allo stadio L1 su una piastra OP50 da 60 mm. Ad esempio, seminare 10 μL di una coltura di larve che ha una densità di 10 larve L1/1 μL di coltura.
nota: Non superare un volume di 40 μl per seminare le larve, altrimenti il liquido in eccesso interromperà il prato OP50. Se il volume di coltura supera i 40 μl, ripetere i passaggi 2.3-2.4 per ridurre ulteriormente il volume e aumentare la densità della coltura delle larve.
- Coltivare i vermi a 24 °C. Registrare il momento in cui gli L1 vengono seminati su piastra e controllare periodicamente lo stadio di sviluppo per identificare il momento ideale per la dissezione.
nota: A 52 ore dalla semina degli L1, i vermi coltivati a 24 °C sono tipicamente nello stadio di giovane adulto, che è lo stadio ideale per la dissezione del PLA mirato alle gonadi. Tuttavia, il momento effettivo in cui i vermi sincronizzati raggiungono lo stadio di giovane adulto può variare a seconda dei ceppi e della temperatura di incubazione.
3. Dissezione/estrusione di gonadi
NOTA: La dissezione per estrudere la gonade è necessaria affinché il PLA mirato alle gonadi funzioni con successo. Questo approccio può anche rilasciare embrioni, che funzionano anche utilizzando questo protocollo per il PLA (vedi Discussione per ulteriori informazioni). Dopo la dissezione, sia il campione di controllo negativo che quello sperimentale vengono fissati e trattati insieme per PLA in parallelo. Si suggerisce inoltre di preparare un ulteriore set di campioni ai fini della co-immunocolorazione fluorescente per dimostrare i modelli di espressione dei partner proteici di interesse.
- Raccogli 30-40 giovani vermi adulti in un piatto di vetro da orologio contenente 500 μl di 1x M9 + levamisolo (concentrazione finale di 2,5 mM). Dopo aver raccolto i vermi, rimuovere e scartare con cura la maggior parte del terreno per rimuovere i batteri che vengono trasferiti insieme ai vermi.
- Aggiungere 500 μl freschi di 1x M9 + levamisolo e utilizzare la pipetta per aspirare delicatamente ed erogare il terreno per sciacquare i vermi. Rimuovere e scartare con cura la maggior parte del terreno per eliminare i batteri che vengono trasferiti insieme ai vermi.
- Ripeti questo passaggio 2x-3x fino a quando tutti i batteri non vengono rimossi. Al termine dei lavaggi, lasciare i vermi in circa 100 μL di terreno per mantenerli idratati.
nota: Non lasciare i vermi nel terreno per più di 7 minuti, poiché ciò comprometterebbe l'estrusione delle gonadi durante la dissezione. Eseguire lavaggi con l'aiuto di un microscopio da dissezione per monitorare la rimozione dei terreni in modo che i vermi non vadano persi.
- Utilizzando una pipetta di vetro o polietilene, trasferire i vermi su un vetrino da microscopio di 25 mm x 75 mm rivestito con poli-L-lisina allo 0,001% (i vetrini utilizzati in questa procedura hanno un perimetro rivestito di resina epossidica, lasciando tre spazi di lavoro, 14 mm x 14 mm ciascuno). Rimuovere il terreno in eccesso in modo che rimangano circa 10-15 μL di terreno.
- Con l'aiuto di un microscopio da dissezione e utilizzando due aghi calibro 261/2, posizionare un ago sopra l'altro in modo che le estremità formino un paio di forbici. Usando aghi orientati in questo modo, taglia i vermi dietro la faringe per rilasciare le linee germinali. Sezionare tutti i vermi entro 5 minuti.
nota: Maggiori dettagli su come eseguire le dissezioni possono essere trovati in una precedente pubblicazione di Gervaise e Arur.
- Dopo che tutti i vermi sono stati sezionati, posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti da 22 mm x 40 mm sul vetrino in modo che sia perpendicolare al vetrino. Le estremità del vetrino coprioggetti devono essere appesi al vetrino.
- Congelare i vetrini su un blocco di alluminio pre-raffreddato mantenuto su ghiaccio secco per almeno 20 minuti. Posizionare delicatamente una matita fredda sopra il vetrino coprioggetti per evitare che il vetrino si allenti a causa dell'espansione del ghiaccio.
4. Fissaggio/blocco
- Quando è pronto per il fissaggio, rimuovere i vetrini coprioggetti con una matita o un altro strumento a lama smussata e immergere immediatamente il vetrino in un barattolo contenente metanolo fresco e ghiacciato (raffreddato a -20 °C) per 1 minuto.
- Strofinare delicatamente i bordi del vetrino che circondano il campione in modo che il reagente successivo sia trattenuto dalla tensione superficiale attorno al campione. Applicare 150 μL di fissativo (2% formaldeide in 100 mM KH2PO4, pH = 7,2) per 5 min a RT.
nota: Abbiamo anche testato una procedura di fissazione con metanolo/acetone e abbiamo scoperto che è compatibile con la reazione PLA.
- Toccare il vetrino su un tovagliolo di carta con un angolo perpendicolare di 90° per lasciare che il fissativo scorra dal vetrino e si assorba nel tovagliolo di carta. Bloccare i vetrini 2 volte per 15 minuti a RT in un barattolo Coplin con 50 mL di 1x PBS/1% Triton X-100/1% albumina sierica bovina (PBT/BSA).
nota: Si consigliano barattoli Coplin o altri tipi di barattoli di colorazione per questa fase di blocco e le fasi di lavaggio riportate di seguito nelle sezioni 6-9. Questi forniscono volumi sufficienti per uno scambio efficiente del tampone di blocco o di lavaggio con il campione.
- Bloccare i vetrini con una soluzione di PBT/BSA contenente il 10% di siero normale di capra. Strofinare delicatamente i bordi che circondano il vetrino e applicare 100 μl di soluzione sul vetrino. Incubare per 1 ora a RT in una camera umida.
nota: Questo passaggio è altamente raccomandato per la colorazione con l'anticorpo primario αFLAG. La camera umida è costruita fissando pipette di vetro con nastro adesivo nel vassoio su cui i vetrini possono essere appoggiati durante l'incubazione. Le salviette da lavoro inumidite (Tabella dei materiali) vengono posizionate nel vassoio per aumentare l'umidità interna del vassoio e prevenire l'evaporazione. Il coperchio e il vassoio sono ricoperti da un foglio di alluminio per proteggere i campioni dalla luce durante le fasi sensibili alla luce.
- Posizionare il vetrino su un tovagliolo di carta per far defluire la soluzione PBT/BSA/10%NGS dal vetrino e strofinare delicatamente i bordi del vetrino. Utilizzare il reagente bloccante (Tabella dei materiali) per bloccare i vetrini. Applicare una goccia sullo spazio di 14 mm x 14 mm. Incubare i vetrini per 1 ora a 37 °C in una camera umida.
5. Incubazione degli anticorpi primari
NOTA: Per ottenere i migliori risultati PLA e un background minimo, il fattore di diluizione degli anticorpi primari potrebbe richiedere un'ottimizzazione (vedi Discussione per maggiori dettagli). Inoltre, gli anticorpi primari devono essere aumentati in ospiti diversi che corrispondono alla specificità degli anticorpi secondari utilizzati per il PLA.
- Posizionare il vetrino su un tovagliolo di carta per far defluire il reagente bloccante dal vetrino e strofinare delicatamente i bordi. Utilizzare il diluente anticorpale (Tabella dei materiali) per diluire gli anticorpi primari. Applicare 40 μl di soluzione di anticorpi primari per uno spazio di 14 mm x 14 mm.
- Incubare i vetrini in una camera umida per una notte a 4 °C.
6. Incubazione della sonda PLA (anticorpo secondario)
NOTA: Per i passaggi 6-9, utilizzare i tamponi di lavaggio A e B a RT. Se i tamponi vengono conservati a 4 °C, lasciarli riscaldare a RT prima dell'uso.
- Lavare i vetrini 2 volte per 5 minuti con 50 mL di 1 tampone di lavaggio A (Tabella dei materiali) a RT in un barattolo Coplin. Posizionare il barattolo Coplin su un agitatore orbitale impostato a 60 giri/min.
- Posizionare il vetrino su un tovagliolo di carta per far scorrere il tampone di lavaggio dal vetrino e strofinare delicatamente i bordi. Preparare una soluzione da 40 μl contenente sonde PLUS e MINUS (diluita 1:5 con diluente anticorpale). Applicare la soluzione su ogni spazio di 14 mm x 14 mm.
- Incubare i vetrini in camera umida per 1 ora a 37 °C.
7. Legatura
- Lavare i vetrini 2 volte per 5 minuti con 50 mL di 1 tampone di lavaggio A a RT in un barattolo Coplin. Posizionare il barattolo Coplin su un agitatore orbitale impostato a 60 giri/min.
- Diluire il tampone di legatura (Tabella dei materiali) 1:5 con acqua ultrapura. Utilizzare questo tampone per diluire la ligasi (Tabella dei materiali) 1:40 per preparare una riserva di lavoro di soluzione di legatura.
- Posizionare il vetrino su un tovagliolo di carta per far defluire il tampone di lavaggio dal vetrino e strofinare delicatamente i bordi. Applicare 40 μl della soluzione di legatura in ogni spazio di 14 mm x 14 mm.
- Incubare i vetrini in una camera umida per 30 minuti a 37 °C.
8. Amplificazione
NOTA: L'uso di reagenti di rilevamento con fluorofori rossi (Tabella dei materiali) produce la minima quantità di fondo nel tessuto di C. elegans.
- Lavare i vetrini 2 volte per 5 minuti con 50 mL di 1 tampone di lavaggio A a RT in un barattolo Coplin. Posizionare il barattolo Coplin su un agitatore orbitale impostato a 60 giri/min.
- Diluire il tampone rosso di amplificazione (Tabella dei materiali) 1:5 con acqua ultrapura. Utilizzare questo tampone per diluire la polimerasi (Tabella dei materiali) 1:80 per preparare una scorta di lavoro di soluzione di amplificazione e proteggere dalla luce.
- Posizionare il vetrino su un tovagliolo di carta per far defluire il tampone di lavaggio dal vetrino e strofinare delicatamente i bordi. Applicare 40 μl della soluzione di amplificazione su ogni spazio di 14 mm x 14 mm.
- Incubare i vetrini in una camera umida per 1 ora e 40 minuti a 37 °C. Assicurarsi che la camera umida sia coperta con un foglio per proteggere i campioni dalla luce.
9. Lavaggi finali
- Lavare i vetrini 2 volte per 10 minuti con 50 mL di 1 tampone di lavaggio B (Tabella dei materiali) a RT in un barattolo Coplin. Posizionare il barattolo Coplin su un agitatore orbitale impostato a 60 giri/min.
- Lavare i vetrini 1 volta per 1 minuto con 50 mL di tampone di lavaggio 0,01x B a RT in un barattolo Coplin. Posizionare il barattolo Coplin su un agitatore orbitale impostato a 60 giri/min. Questo tampone viene preparato diluendo il tampone di lavaggio B con acqua ultrapura.
10. Montaggio del vetrino coprioggetti
- Lasciare che il tampone di lavaggio in eccesso scorra via dal vetrino su un tovagliolo di carta e rimuovere eventuali residui di tampone rimasti sul perimetro epossidico del vetrino.
- Aggiungere 10 μl di terreno di montaggio (Tabella dei materiali) al campione e stendere delicatamente un vetrino coprioggetti sulla parte superiore, consentendo al mezzo di montaggio di distendersi.
- Dipingi intorno al bordo del vetrino coprioggetti con lo smalto per unghie per sigillare il vetrino coprioggetti e il vetrino. Sii delicato con l'applicazione dello smalto per evitare di spostare il vetrino, che danneggerà le linee germinali. Lasciare indurire lo smalto per almeno 20 minuti a RT, mentre i vetrini sono protetti dalla luce, prima di osservarlo al microscopio.
