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Articolo metodologico

Digestione di proteine su membrana per preparare proteine co-immunoprecipitate per studi di interazione

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8 luglio 2025

In questo articolo

Abstract

Fonte: Obama, T. et al., Valutazione delle interazioni proteina-proteina utilizzando una tecnica di digestione su membrana.J. Vis. Exp.(2019)

Questo video mostra complessi proteici co-immunoprecipitati su una membrana PVDF per l'analisi dell'interazione proteina-proteina. Le proteine ridotte dei complessi sono state trattate con tripsina per scindere le singole proteine in corrispondenza dei peptidi più piccoli, quindi i peptidi rimanenti sono stati estratti dalla membrana in PVDF. Il peptide estratto derivato da entrambe le proteine del complesso è stato quindi essiccato e risospeso in una bassa concentrazione di acido formico per ulteriori analisi.

Protocollo

1. Immunoprecipitazione

NOTA: Abbiamo utilizzato un tampone di lisi dodecil solfato (SDS) non sodio e l'eluizione del citrato, come descritto nelle sezioni seguenti. Tuttavia, l'uso di una tecnica di immunoprecipitazione interna alternativa può essere applicabile anche per la preparazione di campioni LC-MS/MS.

  1. Trasfettare le cellule in coltura con vettori che codificano un tag epitopo da solo o una proteina di fusione. Per acquisire dati rappresentativi, trasferire cellule J774 (1 x 106) con vettori che codificano per una sola proteina fluorescente verde (GFP) o Capn6 (gene della calpaina-6) fusa con ....

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
acetonitrileWakoCodice 014-00386
acido citricoWakoCodice 030-05525
DTTNacalai tesqueCodice 14112-94
Proteina G di DynabeadsThermo Fisher Scientifico10003D
acido formicoWakoCodice 066-00461
IodoacetammideWakoCodice 095-02151
Lipofectamina 3000Thermo Fisher ScientificoL3000008
Anticorpo monoclonale Living Colors A.v. (JL-8)ClontechCodice 632380
NaClWakoCodice 191-01665
NH4HCO3WakoCodice 018-21742
Nonidet P-40sigmaN6507Poli(ossietilene) ottilfenil etere (n=9)
Cocktail di inibitori della proteasisigmaP8465
Grado di sequenziamento Tripsina modificataPromegaV5111tripsina
Ortovanadato di sodiosigmaS6508
Sodio fosfato bibasico diidratosigmaCodice 71643
AlessioWakoCodice 206-10731
TrisWakoCodice 207-06275
Interpolazione-20WakoCodice 160-21211

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