1. Immunoprecipitazione
NOTA: Abbiamo utilizzato un tampone di lisi dodecil solfato (SDS) non sodio e l'eluizione del citrato, come descritto nelle sezioni seguenti. Tuttavia, l'uso di una tecnica di immunoprecipitazione interna alternativa può essere applicabile anche per la preparazione di campioni LC-MS/MS.
- Trasfettare le cellule in coltura con vettori che codificano un tag epitopo da solo o una proteina di fusione. Per acquisire dati rappresentativi, trasferire cellule J774 (1 x 106) con vettori che codificano per una sola proteina fluorescente verde (GFP) o Capn6 (gene della calpaina-6) fusa con GFP utilizzando liposomi cationici.
- Anticorpo coniugato contro le microsfere magnetiche.
- A tale scopo, miscelare l'anticorpo anti-GFP (2 μL/reazione) con biglie magnetiche (25 μL/reazione) in 500 μL di tampone citrato fosfato (24,5 mM di acido citrico, 51,7 mM di fosfato di sodio bibasico; pH 5,0) in una provetta da 1,5 mL.
- Ruotare il composto a 50 giri/min per 1 ora a temperatura ambiente. Quindi, lavare le perle coniugate IgG tre volte con un tampone citrato fosfato contenente lo 0,1% di poliossietilene (20) monolaurato di sorbitano.
- Lisi le cellule trasfettate utilizzando un tampone di lisi appropriato. Per l'acquisizione di dati rappresentativi, lisare le cellule trasfettate per 30 minuti su ghiaccio in 400 μL di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl; pH 7,5, 120 mM NaCl, 0,5% poli(ossietilene) ottilfeniletere) contenente 40 μmol/L di fenilmetilsulfonilfluoruro, 50 μg/mL di leupeptina, 50 μg/mL di aprotinina, 200 μmol/L di ortovanadato di sodio, e 1 mM di acido etilenglicole tetraacetico (EGTA) in provette da 1,5 mL 24 ore dopo la trasfezione.
- Eliminare il lisato centrifugando a 15.000 x g per 5 minuti e raccogliere il surnatante.
- Preclear il lisato. Aggiungere microsfere magnetiche non marcate (25 μL/reazione) in una provetta da 1,5 mL. Lavare le perle tre volte con 500 μL di tampone citrato fosfato. Dopo aver rimosso il tampone citrato fosfato nel lavaggio finale, aggiungere il lisato cellulare sulle perle magnetiche. Ruotare il composto utilizzando un rotatore a 50 giri/min per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Posizionare la provetta su un supporto magnetico per 5 minuti per la separazione magnetica e raccogliere il lisato cellulare. Si consiglia l'uso del supporto magnetico designato dal produttore.
- Legare le proteine bersaglio alle perle coniugate. Posizionare le perle coniugate con immunoglobulina (Ig)G su un supporto magnetico per 5 minuti per la separazione magnetica, scartare il tampone citrato e quindi aggiungere il lisato cellulare alle perle separate.
- Ruotare il composto a 50 giri/min per 1 ora a temperatura ambiente.
- Separare le proteine bersaglio dalle proteine libere non bersaglio. Lavare le perle tre volte utilizzando 500 μl di tampone citrato fosfato contenente lo 0,1% di poliossietilene (20) sorbitano monolaurato. Dopo il lavaggio finale, aggiungere 30 μl di tampone citrato (pH 2-3) e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per eluire le proteine bersaglio.
nota: Se il recupero dall'immunoprecipitazione è insufficiente, l'uso di tag epitopici alternativi, come FLAG o HIS, può migliorare l'efficienza. Se l'efficienza dell'eluizione è insufficiente, l'uso di altri eluenti, come una soluzione basata su SDS, può migliorare l'efficienza.
2. Digestione delle proteine su membrana
NOTA: L'utilizzo di materiali e attrezzature privi di proteine è necessario per evitare la contaminazione con proteine esogene. Inoltre, si raccomanda all'operatore di indossare una mascherina chirurgica e guanti per evitare la contaminazione da proteine umane.
- Tagliare le membrane in PVDF in pezzi di 3 mm x 3 mm utilizzando forbici chirurgiche che sono state pulite con metanolo e asciugate immediatamente prima dell'uso.
- Aggiungere 2-5 μl di etanolo ai pezzi di membrana in PVDF su un foglio di alluminio pulito.
- Prima che si asciughino completamente, aggiungere l'eluente (2-5 μl ciascuno, 4-6 pezzi per campione) sulle membrane idrofile in PVDF, quindi asciugare le membrane all'aria fino a quando la superficie della membrana non diventa opaca. Le membrane essiccate possono essere conservate a 4 °C.
- Trasferire tutte le membrane in provette di plastica da 1,5 ml, aggiungere 20-30 μl di etanolo per rendere le membrane idrofile, quindi rimuovere l'etanolo utilizzando una pipetta.
- Prima che la membrana si asciughi completamente, aggiungere 200 μl di soluzione di reazione a base di ditiotreitolo (DTT) (80 mM NH4HCO3, 10 mM DTT e 20% acetonitrile) e incubarla a 56 °C per 1 ora.
- Sostituire la soluzione di reazione con 300 μL di soluzione di iodoacetammide (80 mM NH4HCO3, 55 mM di iodoacetamide e 20% di acetonitrile) e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Lavare le membrane due volte con 1 mL di acqua distillata e una volta con 1 mL di acetonitrile al 2% mescolando a vortice per >10 s.
- Sciogliere la tripsina liofilizzata di grado MS (Tabella dei materiali) direttamente nella soluzione di reazione (30 mM NH4HCO3 contenente il 70% di acetonitrile). Aggiungere 100 μl della soluzione di reazione contenente 1 μg di tripsina (Tabella dei materiali) (30 mM NH4HCO3 contenente il 70% di acetonitrile) e incubare a 37 °C per una notte.
- Trasferire la soluzione di reazione contenente i digestati triptici in una provetta pulita da 1,5 mL utilizzando una pipetta.
- Aggiungere 100 μL di soluzione di lavaggio (70% acetonitrile/1% acido trifluoroacetico) alla membrana e incubarla a 60 °C per 2 ore. Raccogliere la soluzione di lavaggio e mescolarla con la soluzione di reazione. Aggiungere altri 100 μL di soluzione di lavaggio alla membrana e sonicarla per 10 minuti. Quindi raccogliere la soluzione di lavaggio e mescolarla con la soluzione di reazione.
- Coprite la provetta con un pezzo di pellicola da laboratorio e praticate un paio di piccoli fori con un ago. Asciugare la soluzione utilizzando un concentratore sottovuoto.
- Sciogliere il residuo in 10 μL di acido formico allo 0,2%. Dopo la centrifugazione (12.000 × g, 3 minuti a temperatura ambiente), trasferire il surnatante in una provetta per campioni.
nota: I lavaggi sono i passaggi critici di questa sezione. Durante la digestione delle proteine sulla membrana, il lavaggio delle membrane contenenti le proteine immobilizzate dopo la riduzione e l'alchilazione con acqua distillata, seguita da acetonitrile al 2%, per più di 10 secondi ciascuna, è fondamentale per la rimozione dei reagenti.
