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1. Idratazione del biosensore e configurazione del saggio
- Accendere la macchina BLItz.
- Assicurarsi che la macchina sia collegata al computer tramite una porta di uscita dati USB sul retro della macchina.
- Sul computer, apri il software associato (ad esempio, BLItz Pro) e fai clic su Advanced Kinetics sul lato sinistro dello schermo.
- Sul software, digitare tutte le informazioni appropriate sull'esperimento (inclusi il nome dell'esperimento, la descrizione, l'ID del campione e la concentrazione di proteine) sotto ciascuna rispettiva intestazione.
- Fare clic su Tipo di biosensore e scegliere Ni-NTA dal menu a discesa.
- Sotto l'intestazione Impostazioni di esecuzione, verificare che lo shaker sia impostato su Abilita.
- Sotto l'intestazione Elenco tipi di passaggio, verificare che siano elencati 5 elementi: Baseline iniziale, Caricamento, Baseline, Associazione e Dissociazione.
nota: La durata di ogni passaggio può essere modificata rispetto all'impostazione predefinita in base alle esigenze. Per ottenere risultati ottimali, utilizzare un minimo di 30 s per la linea di base iniziale e la linea di base; e 120 s per Associazione e Dissociazione. La durata della fase di carico (che varia da 120 a 240 s) dipenderà dalla concentrazione del ligando e dall'affinità del tag His-epitopo sul ligando al biosensore Ni-NTA.
- Rimuovere il biosensore Ni-NTA idrato dalla provetta PCR e fissarlo al supporto del biosensore sulla macchina facendo scorrere l'ampia parte del biosensore sul supporto.
nota: Non lasciare che il biosensore si asciughi durante l'esperimento.
- Inserire una provetta per microcentrifuga nera da 0,5 mL nel portaprovette della macchina e pipettarvi 400 μL di tampone BLI.
- Verificare che il cursore della macchina sia posizionato in modo tale che il portatubo si trovi davanti alla freccia nera sulla macchina.
- Chiudere il coperchio della macchina in modo che la punta del biosensore venga immersa nel tampone della provetta della microcentrifuga.
- Fare clic su Avanti sul software per iniziare a registrare la baseline iniziale.
2. Caricamento del ligando sul biosensore
- Al termine della registrazione del passaggio Initial Baseline, aprire il coperchio della macchina.
- Spostare il cursore verso destra in modo che il supporto della goccia (invece del supporto del tubo) si trovi davanti alla freccia nera.
- Pipettare 4 μL di un ligando dializzato marcato con His-tagging sul supporto per gocce e chiudere il coperchio della macchina.
NOTA: La concentrazione ottimale del ligando da utilizzare può variare per ogni proteina. Una concentrazione compresa tra 1,0 e 2,0 mg/mL è solitamente adeguata per saturare l'NTA sulla punta del biosensore in 240 s.
- Sul software, fare clic su Avanti per avviare il caricamento.
3. Lavare via il ligando aggiuntivo
- Al termine della registrazione nella fase di caricamento, aprire il coperchio della macchina.
- Spostare il cursore verso sinistra in modo che il supporto del tubo si trovi nuovamente davanti alla freccia nera.
- Chiudere il coperchio della macchina e assicurarsi che la punta del biosensore sia immersa nel tampone BLI della provetta nel supporto della provetta.
- Fare nuovamente clic su Avanti sul software per avviare la registrazione della baseline.
4. Associazione dell'analita al ligando
- Al termine della registrazione del passaggio Linea di base, aprire il coperchio della macchina.
- Rimuovere il portagocce e pulirlo pipettando tutte le proteine e risciacquandolo con acqua a doppia deionizzazione (ddH2O) per un totale di 5 volte.
- Utilizzare un panno per pulire la superficie del portagocce dopo il lavaggio.
- Riposizionare il supporto di caduta sulla macchina.
- Spostare il cursore sulla macchina verso destra in modo che il supporto della caduta si trovi nuovamente davanti alla freccia nera.
- Pipettare 4 μl di analita dializzato sul supporto per gocce e chiudere il coperchio della macchina.
- Sul software, fare clic su Avanti per avviare l'associazione.
5. Dissociazione dell'analita dal ligando
- Al termine della registrazione del passaggio di associazione, aprire il coperchio della macchina.
- Spostare il cursore della macchina verso destra in modo che il supporto del tubo si trovi nuovamente davanti alla freccia nera.
- Sul software, fare clic su Avanti per avviare la dissociazione.
- Al termine della registrazione della fase di dissociazione, aprire il coperchio della macchina.
- Rimuovere il supporto per gocce e il supporto per tubi.
- Sciacquare accuratamente entrambi con ddH2O per lavare via le proteine.
- Rimuovere il biosensore e gettarlo in modo sicuro.