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1. Preparazione del campione: Saggio di miscelazione cellula-cellula
NOTA: Il seguente protocollo descrive la procedura di miscelazione per le cellule aderenti. Può essere modificato per le cellule coltivate in sospensione.
- Seminare un numero appropriato di cellule su una piastra a 6 pozzetti, ad esempio 800.000 cellule HEK 293T (contate con una camera di conteggio Neubauer), un giorno prima della trasfezione. Il numero può essere modificato a seconda del tempo che intercorre tra la semina e la trasfezione e regolato per altri tipi di cellule. Per eseguire un esperimento di base (cioè proteine di interesse e controllo negativo), preparare almeno 4 pozzetti. Colture di cellule a 37 °C, 5% di CO2 in terreno DMEM (Modified Eagle Medium) di Dulbecco, integrate con siero fetale bovino (10%) e L-glutammina (1%).
- Trasfettare le celle secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
- Per eseguire un esperimento di base, trasfettare, in pozzetti separati, plasmidi per la proteina di interesse fusi in una proteina fluorescente 'verde' (ad esempio, proteina fluorescente verde potenziata monomerica (mEGFP) o proteina fluorescente gialla (mEYFP)) o 'rossa' (ad esempio, mCherry o mCardinal).
nota: In questo protocollo, ci concentriamo su APLP1-mEYFP e APLP1-mCardinal, e sul corrispondente controllo negativo, ad esempio, miristoilato-palmitoilato-mEYFP (myr-palm-mEYFP) e -mCardinal (myr-palm-mCardinal). Generalmente, 200 ng - 1 μg di DNA plasmidico sono sufficienti. L'elevata efficienza di trasfezione aumenta la possibilità di trovare celle "rosse" e "verdi" in contatto. Modifica la quantità di plasmide e reagente di trasfezione per ottimizzare l'efficienza della trasfezione. critico: La confluenza cellulare dovrebbe essere di circa il 70% durante la trasfezione delle cellule. Se le celle sono troppo confluenti, l'efficienza di trasfezione diminuirà. Se le cellule non sono sufficientemente confluenti, la trasfezione e la miscelazione possono indurre stress e impedire a molte cellule di attaccarsi correttamente dopo la miscelazione.
- Eseguire la miscelazione delle cellule ~4 ± 2 ore dopo la trasfezione.
- Rimuovere il terreno di coltura e lavare delicatamente ogni pozzetto con 1 mL di PBS integrato con Mg2+ e Ca2+. Quindi, rimuovere il PBS. (Critico) Far cadere il PBS sul bordo del pozzetto per evitare il distacco delle cellule durante il lavaggio.
- Aggiungere ~50 μL di soluzione di acido etilendiamminingamintetraacetico (EDTA) di tripsina goccia a ciascun pozzetto per facilitare il distacco delle cellule. Incubare a 37 °C per 2 min. Successivamente, agitare lentamente la piastra a 6 pozzetti lateralmente per staccare le cellule.
nota: Per alcuni tipi di cellule possono essere necessari tempi di incubazione prolungati.
- Aggiungere 950 μl di terreno di coltura a ciascun pozzetto e risospendere le cellule pipettando alcune volte su e giù, staccando così tutte le cellule dal fondo del pozzetto. (Critico) Assicurarsi che le cellule siano risospese correttamente e staccate l'una dall'altra controllando visivamente l'assenza di grandi aggregati cellulari dopo la risospensione. In caso contrario, dopo la miscelazione si otterranno molti contatti "rosso"-"rosso" o "verde"-verde".
- Trasferire la soluzione cellulare di un pozzetto (proteina di interesse o controllo negativo) nel pozzetto corrispondente, cioè cellule "rosse" (ad esempio, APLP1-mCardinal trasfettate) in cellule "verdi" (ad esempio, APLP1-mEYFP trasfettate). Mescolare pipettando delicatamente alcune volte su e giù. Quindi, seminare le cellule miste su piastre con fondo di vetro da 35 mm (1 mL di soluzione cellulare mista per piatto, più 1 mL di terreno di crescita) e coltivare le cellule seminate per un altro giorno a 37 °C, 5% CO2.
2. Preparazione del campione: controllo positivo per esperimenti di correlazione incrociata e costrutto omo-dimero per l'analisi della luminosità
- Semina 600.000 cellule HEK 293T, contate con una camera di conteggio delle cellule, su piastre con fondo di vetro da 35 mm un giorno prima della trasfezione. Coltivare le cellule a 37 °C, 5% di CO2 in un terreno DMEM completo (vedere passaggio 1.1) per un altro giorno.
- Incollare le cellule con ~250 ng di DNA plasmidico secondo le istruzioni del produttore. Per il controllo positivo della correlazione incrociata, utilizzare un plasmide codificante un etero-dimero proteico fluorescente ancorato alla membrana, ad esempio myr-palm-mCherry-mEGFP o myr-palm-mCardinal-mEYFP corrispondenti ai FP della proteina di interesse. Per la calibrazione della luminosità, utilizzare plasmidi codificanti sia un monomero FP ancorato alla membrana che un omo-dimero corrispondenti agli FP fusi alla proteina di interesse, ad esempio myr-palm-mEYFP e myr-palm-mEYFP-mEYFP per calibrare l'analisi della luminosità di APLP1-mEYFP.
- Colture di cellule a 37 °C, 5% di CO2 in terreno DMEM completo (vedere passaggio 1.1) per un altro giorno.
3. Microscopia a scansione laser confocale: configurazione e calibrazione del volume focale
NOTA: Il seguente protocollo è scritto per gli esperimenti eseguiti con mEGFP/mEYFP e mCherry/mCardinal sul microscopio confocale a scansione laser utilizzato in questo studio. La configurazione ottica, le impostazioni del software (linee laser, specchi dicroici, filtri) e la scelta dei coloranti di calibrazione possono essere modificate per altri FP e configurazioni di microscopio.
- Accendere il microscopio e i laser almeno un'ora prima dell'esperimento per garantire la stabilità del laser e l'equilibrio della temperatura.
- Preparare 100-200 μl di soluzioni coloranti fluorescenti solubili in acqua appropriate (vedere la Tabella dei materiali per esempi) in acqua o PBS per calibrare il volume focale, con concentrazioni nell'intervallo 10-50 nM.
- Posizionare le soluzioni coloranti su un piatto pulito con fondo di vetro da 35 mm #1.5, cioè con uno spessore di 0.16-0.19 mm.
nota: Idealmente, utilizzare piastre con vetro di copertura ad alte prestazioni con una bassa tolleranza di spessore, ad esempio 0,170 ± 0,005 mm, consentendo una correzione ottimale dell'anello del collare (passaggio 3.6). È importante utilizzare lo stesso tipo di piatto utilizzato in seguito per i seguenti esperimenti.
- Posizionare il piatto contenente la soluzione colorante direttamente sull'obiettivo (preferibilmente immersione in acqua, con NA 1,2) per garantire la messa a fuoco nella soluzione. In alternativa, posizionare il piatto sul portacampioni e mettere a fuoco il campione (ad esempio, 10-20 μm sopra il fondo del piatto).
NOTA: Si sconsiglia l'uso di obiettivi a olio a causa dello scarso segnale che si ottiene quando si mette a fuoco in profondità i campioni acquosi.
- Imposta il percorso di eccitazione ed emissione, ad esempio, scegli il laser a 488 nm, uno specchio dicroico a 488/561 nm, una finestra di rilevamento a 499-552 nm e una dimensione del foro stenopeico di 1 unità Airy (AU). Assicurarsi che la dimensione del foro stenopeico sia la stessa di quella che verrà utilizzata nelle misurazioni di correlazione incrociata.
- Regolare la posizione del foro stenopeico (regolazione del foro stenopeico) e l'anello del collare dell'obiettivo per massimizzare la velocità di conteggio. A tale scopo, ruotare l'anello del collare fino a quando non viene rilevata la velocità di conteggio massima.
nota: La correzione dell'anello del collare tiene conto dello spessore specifico del vetro di copertura utilizzato. Massimizzare la velocità di conteggio, ovvero raccogliere il maggior numero possibile di fotoni per molecola, è fondamentale per massimizzare il rapporto segnale/rumore (SNR) delle misurazioni.
- Eseguire una serie di misurazioni FCS puntuali (ad esempio, 6 misurazioni in posizioni diverse, ciascuna composta da 15 ripetizioni di 10 s, ovvero 2,5 minuti di tempo totale, campionate con un tempo di permanenza di 1 μs o meno) alla stessa potenza laser utilizzata nelle misure di correlazione incrociata (in genere ~1%, ovvero ~1-2 μW).
- Adattare ai dati un modello di diffusione tridimensionale che includa un contributo di tripletta (equazione 1).
nota: Tipicamente, i tempi di diffusione ottenuti sono di circa 30 μs e il fattore di struttura è di circa 4-8.
- Calcolare la vita w0 dal tempo medio di diffusione misurato e dai valori pubblicati per il coefficiente di diffusione del colorante utilizzato a temperatura ambiente secondo l'equazione 2.
I valori tipici sono 200-250 nm.
- Ripetere la routine di calibrazione (passaggi 3.4-3.9) con un colorante fluorescente diverso per un secondo canale di rilevamento, se necessario (ad esempio, eccitazione a 561 nm e rilevamento tra 570 nm e 695 nm). Mantenere la posizione e le dimensioni del foro stenopeico come sono state impostate per il primo canale di rilevamento.
- Calcolare la luminosità molecolare (Equazione 3) dalle misure di calibrazione e memorizzare i valori ottenuti.
nota: I valori tipici per la configurazione utilizzata sono ~8-10 kHz/molecola (MOL) per una potenza di eccitazione di 1,8 μW 488 nm. Valori più bassi del solito potrebbero indicare sporcizia sull'obiettivo, disallineamento della configurazione o una potenza laser ridotta. Controllare e conservare regolarmente le potenze di uscita del laser sull'obiettivo utilizzando un misuratore di potenza. Per il confronto di diverse configurazioni, la luminosità molecolare normalizzata dalla potenza del laser di eccitazione è il parametro più significativo per valutare le prestazioni del microscopio.
4. Spettroscopia di correlazione incrociata a fluorescenza a scansione: acquisizione
NOTA: Il seguente protocollo è scritto per gli esperimenti eseguiti con mEGFP/mEYFP ('verde') e mCherry/mCardinal ('rosso') sul microscopio confocale a scansione laser utilizzato in questo studio. La configurazione ottica e le impostazioni del software (linee laser, specchi dicroici, filtri) possono essere diverse per altri FP o configurazioni di microscopio.
- Impostare il percorso ottico, ad esempio, un'eccitazione di 488 nm e 561 nm e uno specchio dicroico di 488/561 nm, foro stenopeico su 1 UA per un'eccitazione di 488 nm. Per evitare la diafonia spettrale, selezionare due tracce separate per eccitare e rilevare mEGFP/mEYFP (eccitazione a 488 nm, canale verde) e mCherry/mCardinal (eccitazione a 561 nm, canale rosso) in sequenza e selezionare le tracce di commutazione per ogni linea. Per il rilevamento, utilizzare filtri appropriati per entrambi i canali, ad esempio 499-552 nm nel canale verde e 570-695 nm nel canale rosso.
- Se l'eccitazione alternata non è possibile, utilizzare le impostazioni del filtro appropriate per il canale rosso per ridurre al minimo la diafonia spettrale (ad es. rilevare la fluorescenza mCherry/mCardinal non inferiore a 600 nm). Ciò può ridurre la quantità di fotoni rilevati nel canale rosso e quindi ridurre l'SNR.
- Posizionare la piastra contenente le celle mescolate sul supporto del campione. Attendere almeno 10 minuti per garantire l'equilibrio della temperatura e ridurre la deriva della messa a fuoco.
- Mettere a fuoco le celle utilizzando la luce di trasmissione nel menu Localizza.
- Cerca una coppia di celle "rosse" e una "verde" in contatto tra loro. Per la correlazione incrociata positiva o il controllo della luminosità dell'omo-dimero (vedere la sezione 2), cercare una cella isolata che emette fluorescenza in entrambi i canali o il rispettivo segnale omo-dimero al PM.
NOTA: (Critico) Ridurre al minimo l'esposizione del campione durante la ricerca delle cellule per evitare il pre-sbiancamento, che potrebbe ridurre la correlazione incrociata. Pertanto, eseguire la scansione alla massima velocità di scansione e con basse potenze laser. Per evitare la saturazione del rivelatore durante l'imaging di cellule che esprimono fortemente, eseguire la ricerca in modalità di integrazione. Tuttavia, per ridurre al minimo l'esposizione, è possibile eseguire la scansione a potenze laser inferiori in modalità di conteggio dei fotoni.
- Selezionare un percorso di scansione perpendicolare al contatto cellula-cellula (o al PM di una singola cella per la correlazione incrociata positiva o il controllo della luminosità dell'omo-dimero) utilizzando il pulsante Ritaglia come illustrato nelle Figure 1B e 2A.
nota: Alcuni microscopi più vecchi non consentono direzioni di scansione arbitrarie. In questo caso, è necessario localizzare i contatti cellula-cellula con un orientamento perpendicolare alla direzione di scansione.
- Ingrandisci per ottenere una dimensione dei pixel di 50-200 nm e seleziona Linea in modalità di scansione. Imposta la dimensione del fotogramma su 128 × 1 pixel.
nota: La dimensione tipica dei pixel è di 160 nm, corrispondente a una lunghezza di scansione di circa 20 μm.
- Impostare la velocità di scansione sul valore massimo consentito, ad esempio 472,73 μs per linea.
nota: Per uno schema di eccitazione alternativo, ciò corrisponde a un tempo di scansione di 954,45 μs, ovvero ~1000 scansioni/s sulla configurazione utilizzata. La velocità di scansione può essere regolata in base al coefficiente di diffusione della proteina di interesse. Per le proteine ancorate alla membrana, i tempi di diffusione tipici sono di circa 10-20 ms. Il tempo di scansione deve essere almeno dieci volte inferiore ai tempi di diffusione. Velocità di scansione più basse possono indurre un fotobleaching più forte e richiedere potenze di illuminazione inferiori. In alternativa, è possibile imporre una pausa, ad esempio 5 ms, tra ogni scansione per complessi a diffusione molto lenta utilizzando Intervallo nel sottomenu Serie temporale.
- Scegliere le potenze laser appropriate, ad esempio ~1-2 μW per 488 nm e ~5-10 μW per un'eccitazione di 561 nm.
nota: Potenze laser più elevate migliorano l'SNR, ma aumentano il fotosbiancamento. Pertanto, le potenze laser dovrebbero essere scelte in modo tale che il fotobleaching sia inferiore al 50% del tasso di conteggio iniziale.
- Impostare i cicli su 100.000-500.000.
nota: Il numero di scansioni, ovvero la durata della misurazione, può variare: tempi di misurazione più lunghi miglioreranno l'SNR e potrebbero essere più appropriati per le molecole che si diffondono lentamente, tuttavia, il movimento delle cellule e il fotosbiancamento limitano il tempo massimo di misurazione. I dati qui presentati sono stati acquisiti di routine per ~3-6 minuti, ovvero 200.000-400.000 scansioni di linea.
- Impostare i rilevatori sulla modalità di conteggio dei fotoni. Premere Avvia esperimento per avviare l'acquisizione. Ripetere i passaggi 4.5-4.11 per misurare un'altra cella.
nota: Si consiglia di misurare 10-15 cellule per campione a diversi livelli di espressione. (Critico) Evitare la saturazione del rivelatore ad alti livelli di espressione. La velocità di conteggio massima non deve superare ~1 MHz.
- Se l'analisi della luminosità viene eseguita per determinare gli stati oligomerici, eseguire le misure di calibrazione della luminosità dell'omo-dimero secondo i passaggi modificati 4.1-4.11: Misurare ciascun omo-dimero della proteina fluorescente separatamente (in cellule isolate, preparate utilizzando la sezione 2 del protocollo) ed eseguire le misurazioni in un solo canale spettrale.
