Saggio di immunoprecipitazione per studiare le interazioni dei recettori enzimatici nelle cellule trasfettate

Abstract

Fonte: Strazza, M., et al. Co-immunoprecipitazione per lo studio delle interazioni funzionali tra recettori ed enzimi. J. Vis. Exp. (2018).

In questo video, dimostriamo una tecnica per eseguire la co-immunoprecipitazione di proteine PD-1 wild-type e mutate marcate con GFP utilizzando perle rivestite con anticorpi anti-GFP. Le proteine PD-1-GFP legate al bead-bound sono incubate con proteine SHP2 che interagiscono con PD-1, consentendo l'identificazione di specifici motivi strutturali in PD-1 che svolgono un ruolo critico nell'interazione con SHP2.

Protocollo

1. Immunoprecipitazione

NOTA: I seguenti passaggi devono essere eseguiti su ghiaccio o a 4 °C.

1. Integrare il tampone di lisi (50 mM di Tris-HCl a pH 7,2, 250 mM di NaCl, 0,1% NP-40, 2 mM di EDTA, 10% di glicerolo) con inibitori della proteasi (sciogliere 1 compressa in 10 mL di tampone di lisi) e con 1 mM di ortovanadato di sodio. Aggiungere 500 μl di tampone di lisi ghiacciato alle cellule e rimuovere e raccogliere immediatamente le cellule dalle piastre utilizzando un raschietto cellulare.
   nota: È importante aggiungere l'ortovanadato di sodio solo al tampone di lisi che verrà utilizzato per le piastre trasfettate con PD-1-GFP, poiché le piastre trasfettate con SHP2 e le piastre di controllo non trasfettate devono mantenere l'attività della fosfatasi.
2. Trasferire i lisati in provette fredde da 1,5 mL e ruotarle a 0,005 x g, 4 °C per 30 min.
3. Per raccogliere il surnatante dei postnuclei (PNS) dai lisati, centrifugare i lisati per 10 minuti a 10.000 x g a 4 °C e trasferire i surnatanti in nuove provette. Scartare il pellet. Conservare i surnatanti della seconda serie di sei piastre (Figura 1) su ghiaccio per la successiva analisi del lisato a cellula intera.
4. Preparazione delle perle anti-GFP per l'immunoprecipitazione di PD-1-GFP dai lisati trasfettati di PD-1-GFP del primo set (quattro piastre) (Figura 1).
   1. Per evitare che le perle si depositino, agitare delicatamente il flacone con le perline prima di aprirlo. Rimuovere 40 μl di perle anti-GFP dal liquame per ogni condizione.
   2. Centrifugare a 500 x g per 3 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante per lavare le perline.
      nota: È importante ridurre al minimo il contatto tra i puntali di plastica della pipetta e le perle di agarosio per evitare perdite. Si consiglia di tagliare il bordo di un puntale da 200 μl prima di trasferire le perle in un'altra provetta.
   3. Risospendere le perle in 80 μL di tampone di lisi (per campione).
5. Aggiungere le perle lavate direttamente al lisato cellulare (PNS) dalle cellule che esprimono PD-1-GFP della prima serie (quattro piastre) (passaggio 1.3). Ruotare a 0,005 x g per 30 minuti a 4 °C per immunoprecipitare le proteine marcate con GFP.
6. Lavare le perle con 1 mL di tampone di lisi a freddo (senza ortovanadato) 3 volte. Centrifugare la provetta a 2.500 x g per 10 s.
   nota: Quando si aggiunge il tampone di lisi alle perline, aggiungerlo direttamente sulle perle senza toccarle con le punte. Non è necessario pipettare su e giù durante i lavaggi.
7. Allo stesso modo, dividere il lisato dell'attivo SHP2 dal primo set (una piastra; passaggio 1.3) e aggiungerlo a tre provette di perle lavate contenenti PD-1-GFP (WT PD-1-GFP e le due diverse mutazioni fosfo-deficienti, Y223F e Y248F). Aggiungere un terzo del volume del lisato delle cellule non trasfettate alla seconda provetta delle perle WT PD-1-GFP. Scartare i restanti due terzi.
8. Incubare le perle per 4 ore a 4 °C con una rotazione delicata (0,005 x g).
9. Lavare le perle due volte con 1 mL di tampone di lisi a freddo (senza pervanadato o ortovanadato), come riportato al punto 1.6.
10. Aggiungere 80 μl di tampone di lisi (senza pervanadato o ortovanadato) per campione, assicurandosi che il volume totale in ciascuna provetta sia di 100 μl (20 μl di perle e 80 μl di tampone di lisi). Miscelare delicatamente e trasferire 50 μl da ciascuna provetta in due provette fresche da 1,5 mL.
    nota: Dopo questo passaggio, ci saranno due provette riempite con una miscela che contiene perle e tampone di lisi. Una delle provette sarà utilizzata per testare il co-immunoprecipitato SHP2 mediante western blotting.

2. Analisi del Western Blot SHP2

1. Girare le perline e rimuovere il surnatante.
2. Aggiungere 20 μl di 2x tampone Laemmli (vedere la tabella dei materiali) alle perle e far bollire a 95 °C per 5 minuti.
3. Misurare la concentrazione proteica dei controlli di input (seconda serie) utilizzando un kit BCA (vedere la tabella dei materiali). Trasferire 30 μl del campione più diluito in una nuova provetta. Diluire il resto dei controlli di input con il tampone di lisi alla stessa concentrazione del campione più diluito e trasferire 30 μl da ciascuno di essi a una nuova provetta.
   nota: Dopo questa fase, ci saranno 4 provette da 30 μL ciascuna, a concentrazioni proteiche simili, che rappresentano i lisati di controllo in ingresso.
4. Aggiungere volumi uguali di 2x tampone Laemmli ai lisati e far bollire a 95 °C per 5 minuti. Centrifugare le perle e caricare il surnatante su gel a base di Tris SDS-PAGE al 4-20% (vedere la tabella dei materiali) per l'analisi del western blot. Inoltre, caricare 50 μl da ciascun campione del secondo set.
5. Continuare con l'analisi del western blot.

Risultati

Figura 1: Condizioni sperimentali e strategia. GFP-PD-1 WT (wild type), GFP-PD-1 Y223F (mutante ITIM) o GFP-PD-1 Y248F (mutante ITSM) sono stati espressi nelle cellule HEK 293T che sono state successivamente trattate con pervanadato. Le proteine fosforilate GFP-PD-1 raccolte mediante immunoprecipitazione GFP sono state mescolate con lisati di cellule che sovraesprimono SHP2 e sono stati registrati ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Membrane in nitrocellulosa	General Electric	10600004
Microcentrifuga	Eppendorf	5424-R	1,5 ml
BCA	pescatore	Codice 23225	Saggio dell'acido bicinconinico
Anti-SHP2	Santa Cruz	SC-280
Anti-GFP-agarosio	Alessio	D153-8
Anti-GFP	Roche	118144600
Anti-actina	Santa Cruz	SC-1616
Celle HEK-293	ATCC	Codice CRL-1573
Ortovanadato	sigma	S6508
Cocktail di inibitori della proteasi	Roche	11836170001	Senza EDTA
Tampone per campioni SDS Tris-glicina (2x)	Invitrogen	LC2676	Buffer Laemmli modificato
Mini gel 4-20% Tris-glicina	Invitrogen	XP04205BOX	a 15 pozzetti
Tripsina-EDTA (0,25%) Rosso fenolo	Gibco	25200114
NaCl	sigma	S7653	cloruro di sodio