Metodo basato su ELISA per analizzare le interazioni tra le proteine dell'esca e della preda

Abstract

Fonte: Singh, B. et al., Saggi per studiare il ruolo della vitronectina nell'adesione batterica e nella resistenza al siero. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video descrive una tecnica basata su ELISA che rileva le interazioni proteina-proteina tra due proteine misurando il legame della seconda proteina alla prima proteina immobilizzata. La seconda proteina legata viene rilevata utilizzando anticorpi specifici marcati con un enzima, come la perossidasi di rafano.

Protocol

1. Analisi ELISA dell'interazione tra PH ricombinante e Vn

NOTA: I controlli devono essere inclusi per escludere l'associazione non specifica. Il fattore H umano (FH) o la proteina legante C4b (C4BP) sono utilizzati rispettivamente come controlli positivi e negativi.

1. Diluire ciascuna delle proteine umane (Vn, FH e C4BP) separatamente a 50 nM in Tris-HCl, pH 9.0 (tampone di rivestimento). Erogare 100 μL di soluzione proteica in ciascun pozzetto di una piastra per microtitolazione Polysorp. Chiudere le piastre con il coperchio e conservarle a 4 °C per una notte (16 h) per facilitare l'immobilizzazione delle proteine sui pozzetti delle piastre per microtitolazione.
2. Scartare la soluzione dalla piastra per microtitolazione inclinandola a testa in giù sopra il lavandino e lavare i pozzetti tre volte con 300 μL di PBS/pozzetto. Bloccare i pozzetti rivestiti per 1 ora a RT con PBS contenente il 2,5% (p/v) BSA (PBS-BSA).
3. Dopo aver rimosso la soluzione bloccante, lavare i pozzetti tre volte con 300 μL di PBS contenente lo 0,05% (v/v) di Tween 20 (PBST) per pozzetto. Aggiungere 100 μL di PH ricombinante His-taged da 50 nM a ciascun pozzetto del campione e incubare per 1 ora a RT. Nei pozzetti di controllo, aggiungere solo 100 μl di PBS-BSA.
   nota: Il gene lph che codifica per PH da Hif è stato amplificato mediante PCR e clonato nel vettore di espressione pET26b che aggiunge un tag 6× His al C-terminale della proteina espressa. Il vettore ricombinante è stato trasformato in E. coli BL21(DE3) per l'espressione. La resina Ni-NTA è stata utilizzata per purificare la proteina ricombinante.
4. Scartare la soluzione proteica e rimuovere le proteine non legate lavando i pozzetti tre volte con 300 μL di PBST per pozzetto. Aggiungere 100 μL di PBS-BSA contenente anticorpi anti-His coniugati con perossidasi di rafano (HRP) (diluizione 1:10.000) e incubare per 1 ora a RT.
5. Preparare 20 mM di soluzione A sciogliendo la tetrametilbenzidina in una soluzione di acetone al 5% e metanolo al 45%. Per preparare la soluzione B, sciogliere 19,2 g di acido citrico in 1.000 mL di H₂O, regolare il pH a 4,25 aggiungendo KOH, quindi aggiungere 230 μL di 30% H₂O₂. Conservare entrambe le soluzioni al buio presso RT. Poco prima dell'uso, miscelare 500 μL di soluzione B con 9,5 mL di soluzione A per preparare il reagente di rivelazione ELISA.
6. Lavare i pozzetti tre volte con 300 μl di PBST per pozzetto e rilevare i complessi antigene-anticorpo aggiungendo 100 μl di reagente di rilevamento ELISA a ciascun pozzetto.
7. Aggiungere 50 μl di 1 M H₂SO₄/pozzetto per arrestare la reazione. Misurare la densità ottica dei pozzetti a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sensori AR2G	Pall Scienze della vita	Codice 18-5095	Sensore per proteina immobilizzata mediante accoppiamento amminico
acetone	VWR	97064-786	Grado di analisi
Albumine sieriche bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	Codice: A2058	Adatto per colture cellulari
C4BP (proteina legante C4b)	Complemento Tecnologia, Inc.	Visualizzazione del materiale A109	Acquistato come forma liquida congelata
acido citrico	Sigma-Aldrich	Codice 251275-500G	Grado dell'American Chemical Society (ACS)
Anticorpi anti-His tag coniugati con HRP	Abcam	ab1269	Policlonale
C4BP	Complemento Tecnologia, Inc.	Visualizzazione del materiale A109	Soluzione congelata
Colonna in resina per affinità con istidina (HisTrap HP)	GE Health Care Scienze della vita	Codice 17-5247-01	Colonne preconfezionate con Ni Sepharose
PH con tag His.			Estratto in modo ricombinante e purificato nel nostro laboratorio
Metano	VWR	BDH1135-1LP	Grado di analisi
Plasmide contenente C-terminale 6x His-tag sulla spina dorsale (pET26(b))	Novagen	Codice 69862-3	Vettore di DNA
Piastre per microtitolazione Polysorb	Sigma-Aldrich	Codice: M9410	Per ELISA
Tetrametilbenzidina	Sigma-Aldrich	860336-100MG	Grado ELISA
Vitronectina (Vn) dal plasma umano	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	Grado di coltura cellulare