Saggio con biosensore conduttimetrico basato su β-lattamasi per le interazioni proteina-proteina

Abstract

Fonte: Vandevenne, M., et al. L'uso di un saggio di biosensore conduttimetrico basato sulla β-lattamasi, per rilevare le interazioni biomolecolari. (2018)

Questo video mostra un test di biosensore conduttimetrico per studiare l'interazione di un anticorpo con un antigene bersaglio immobilizzato su un chip trasduttore. Il biosensore è progettato per avere una proteina chimerica bifunzionale, un enzima β-lattamasi con un sito catalitico funzionale fuso a un nanocorpo per legarsi all'antigene bersaglio immobilizzato. Dopo il legame, l'idrolisi catalitica di un substrato antibiotico da parte dell'enzima β-lattamasi genera un segnale elettrico, confermando l'interazione antigene-anticorpo.

Protocollo

1. Preparazione del campione di proteine

1. Produrre e purificare la proteina ibrida BlaP-cAb-Lys3 come riportato nel nostro studio precedente. Conservare la proteina in 50 mM di tampone fosfato pH 7,4 con la seguente composizione: 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na₂HPO₄ e 0,24 g di KH₂PO₄ disciolti in 800 mL di acqua distillata Fissare il pH della soluzione a 7,4 prima di regolare il volume finale della soluzione a 1 L. Filtrare sterilizzare la soluzione proteica.
2. Preparare una soluzione madre di lisozima di albume d'uovo di gallina (HEWL). Sciogliere 100 mg (40.000 unità/mg) di HEWL acquistato in commercio in 10 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS, vedere passaggio 2.1.1). Sterilizzare la soluzione proteica mediante filtrazione utilizzando filtri con un cutoff di 0,22 μm.

2. Saggi dei biosensori

1. Preparazione della soluzione e del tampone
   1. Preparare 50 mM di PBS sciogliendo 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na₂HPO₄ e 0,24 g di KH₂PO₄ in 800 mL di acqua distillata. Regolare a pH 7,4 con 1 N HCl o 1 N NaOH prima di regolare il volume della soluzione a 1 L. Sterilizzare con filtro e conservare a 4 °C.
   2. Preparare una soluzione di saturazione/bloccante sciogliendo 3 g di idrolizzato di caseina in 100 mL di PBS preparato come descritto sopra (vedere il passaggio 2.1.1). Filtrare, sterilizzare e conservare a 4 °C.
   3. Preparare una soluzione legante sciogliendo 1 g di idrolizzato di caseina in 100 mL di PBS preparato come descritto sopra (vedere il passaggio 2.1.1). Filtrare, sterilizzare e conservare a 4 °C.
   4. Preparare una soluzione di lavaggio (0,1% Tween - PBS) aggiungendo 100 μL di Tween 20 (100%) in 100 mL di PBS preparato come descritto sopra (vedere il passaggio 2.1.1). Conservare a 4 °C.
   5. Preparare una soluzione di preparazione dell'elettrodo (Triton X-100 - PBS all'1%) aggiungendo 1 mL di Triton X-100 (100%) in 100 mL di PBS preparato come descritto sopra (vedere il passaggio 2.1.1). Conservare a 4 °C.
   6. Preparare una soluzione di rigenerazione degli elettrodi (3,5 M KCl) sciogliendo 26 g di KCl in acqua distillata fino a un volume finale di 100 mL. Filtrare sterilizzato e conservare a 4 °C.
   7. Preparare una soluzione di NaCl 5 mM sciogliendo 0,29 g di NaCl in acqua distillata fino a un volume finale di 1 L. Filtrare, sterilizzare e conservare a 4 °C. Quindi, preparare una soluzione di rilevazione (4 mM di benzilpenicillina) sciogliendo 26,7 mg di benzilpenicillina in 20 mL di soluzione di NaCl 5 mM. Filtrare, sterilizzare e conservare a -20 °C.
2. Preparazione e rigenerazione del sensore
   nota: I chip dei sensori rivestiti in polianilina sono stati sviluppati e gentilmente forniti dal Dr. P. Bogaerts, dal Dr. S. Yunus e dal Prof. Y. Glupczynski (Università Cattolica di Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). La descrizione del sensore e i protocolli di elettropolimerizzazione della polianilina utilizzati per sintetizzare questi sensori sono dettagliati nel loro lavoro precedente. In breve, questo sistema utilizza sensori riutilizzabili di otto singoli chip prodotti con le classiche tecniche dei circuiti stampati (PCB). I singoli chip sono composti da tre punti rotondi dell'elettrodo. Quello superiore è l'elettrodo di lavoro su cui è stata elettrosintetizzata la polianilina. Quello centrale è l'elettrodo di riferimento e l'elettrodo inferiore costituisce il controelettrodo. Sia il riferimento che il controelettrodo sono funzionalizzati utilizzando amalgama solido Ag/AgCl sopra lo strato di carbonio.
   1. Eseguire 3 lavaggi degli elettrodi immergendo le punte nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenente 300 μL/pozzetto di soluzione di preparazione dell'elettrodo (1% Triton X-100 - PBS, vedere il passaggio 2.1.5.). Eseguire ogni lavaggio per 2 minuti mescolando delicatamente a temperatura ambiente.
   2. Sciacquare gli elettrodi immergendo le punte nei pozzetti di una piastra da 96 pozzetti contenente 300 μL/pozzetto di acqua distillata per 2 minuti mescolando delicatamente a temperatura ambiente.
   3. Rigenerare gli elettrodi immergendo le punte nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenente 300 μL/pozzetto di soluzione di rigenerazione (3,5 M KCl, vedere il passaggio 2.1.6) per una notte a 4 °C o 1 ora a temperatura ambiente.
   4. Eseguire 3 lavaggi degli elettrodi immergendo le punte nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenente 300 μL/pozzetto di soluzione salina tampone fosfato (vedere il passaggio 2.1.1.). Eseguire ogni lavaggio per 2 minuti mescolando delicatamente a temperatura ambiente.
3. Saggio di legame eseguito sul sensore
   1. Rivestire l'HEWL sulla superficie PANI (polianilina) dell'elettrodo depositando sulla superficie dell'elettrodo una goccia da 15 μl di 40 μg/mL di HEWL preparata in PBS. Incubare per una notte a 4 °C o 1 ora a temperatura ambiente.
   2. Eseguire tre lavaggi degli elettrodi con soluzione salina tampone fosfato (vedere il passaggio 2.1.1) immergendo le parti dell'elettrodo dei chip del sensore nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenente 300 μl/pozzetto di soluzione salina tampone fosfato. Eseguire ogni lavaggio per 2 minuti mescolando delicatamente a temperatura ambiente.
   3. Saturare gli elettrodi aggiungendo una goccia di 50 μl della soluzione bloccante (vedere il passaggio 2.1.2) sulla superficie dell'elettrodo. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Quindi lavare tre volte come descritto nel passaggio precedente (vedere il passaggio 2.3.2).
   4. Diluire la soluzione di BlaP-cAb-Lys3 a 20 μg/mL in soluzione legante (vedere il passaggio 2.1.3) e applicare una goccia di 15 μL di questa soluzione diluita sugli elettrodi. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la reazione antigene-nanocorpo, lavare tre volte come descritto nel passaggio precedente utilizzando la soluzione di lavaggio (vedere passaggio 2.1.4). Quindi sciacquare l'elettrodo una volta con PBS (vedere il passaggio 2.1.1).
   5. Per il rilevamento, collegare il chip del sensore tramite la parte del circuito in rame a un multimetro digitale. Quindi, avviare la risposta del sensore applicando una goccia di 50 μl di soluzione di rivelazione (vedere il passaggio 2.1.7) sugli elettrodi positivi e applicare una goccia di 50 μl di soluzione di NaCl 5 mM sugli elettrodi negativi (vedere il passaggio 2.1.7). Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Monitora la conduttanza con un multimetro digitale.
      nota: Il multimetro è stato fornito dal Dr. P. Bogaerts, dal Dr. S. Yunus e dal Prof. Y. Glupczynski (Università Cattolica di Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). Questo potenziostato è controllato da computer tramite una porta USB e analizza contemporaneamente gli otto diversi chip del sensore. Il software creato da Yunus e colleghi crea un grafico in tempo reale che rappresenta le misure della differenza di conduttanza tra gli elettrodi di riferimento e quelli del campione rispetto al tempo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti
KH2PO4	Sigma-Aldrich	V000225
K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Tris-HCl	Roche	10812846001
Edta	Sigma-Aldrich	E 9884
Kcl	Sigma-Aldrich	P9541
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	NIST2186II
2-mercaptoetanolo	Sigma-Aldrich	Motore M6250
alanina	Sigma-Aldrich	Codice: A7627
HClO4	Fluka	Telefono 34288	Soluzione HClO4 1M, distributore : Sigma-Aldrich
Idrolizzato di caseina	Sigma-Aldrich	Codice 22090
Benzilpenicillina sodica	Sigma-Aldrich	B0900000
Lisozima dell'albume d'uovo di gallina	Roche	10837059001
eptano	Sigma-Aldrich	246654
metanolo	Sigma-Aldrich	322415
Soluzione di idrossido di ammonio	Sigma-Aldrich	380539	28% NH3 in H2O, purificato mediante doppia distillazione (concentrato?)
Materiali di consumo da laboratorio
Piastra a 6 pozzetti	Greiner Bio-One	657165	Piastra a 6 pozzetti CELLSTAR
attrezzatura
Misuratore di pH	WTW	1AA110	pHmetro da laboratorio inoLab pH 7110
Sistema di vuoto e filtrazione	Nalgene	NALG300-4100	Portafiltri con ricevitore, distributore : VWR
Chip per sensori potenziometrici			prodotto da Yunus e colleghi (rif. 16)
PGSTAT30 Autolab	Metrohm Autolab		fuori produzione, successore Autolab PGSTAT302N
Multimetro digitale, METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		fuori produzione, successore Metrahit Base