1. Celle
- Due giorni prima di iniziare la procedura, piastrate le cellule alla densità richiesta per essere confluenti il giorno dell'esperimento. Placcare le celle in fiasche o piastre. Tuttavia, l'estrazione delle proteine sarà più facile dalle piastre. È conveniente preparare almeno 4 piastre da 78 cm,2 o 2 palloni da 150 cm,2 per condizione per esperimento, per essere sicuri che i risultati siano coerenti.
- In questo studio, le GSC G166 umane sono state piatte in 4 fiasche da 150cm2, coltivate in terreno di cellule staminali RHB-A integrate con 2% B27, 1% N2, 20 ng/mL di EGF e b-FGF come descritto da Pollard et al. Processo quando è stata raggiunta la confluenza. Ad esempio, quando 5 x 106 celle G166 sono state placcate in un pallone da 150 cm2, sono state lavorate 2 giorni dopo la placcatura.
2. CPP biotinilati
- Centrifugare i flaconcini contenenti i CPP biotinilati liofilizzati (BCPP) a 8200 x g per 30 s, per evitare che parte della polvere rimanga sul coperchio. Includi un BCPP di controllo per essere sicuro che le interazioni trovate siano specifiche per la sequenza target. In questo studio, il BCPP di controllo era la TATbiotina (TAT-B) e il BCPP di trattamento era TAT-Cx43266-283-B. Potrebbero essere utilizzati altri controlli, come il TAT fuso con frammenti criptati o mutati legati alla biotina.
- Sciogliere i BCPP nel terreno di coltura corrispondente alla soluzione madre indicata dal produttore; ad esempio, per ottenere una soluzione madre di 2 mg/mL di BCPP per il trattamento delle GSC, aggiungere 0,5 mL di terreno di coltura GSC a un flaconcino contenente 1 mg di BCPP. Vorticare e assicurarsi che il peptide sia ben sciolto.
3. Tubi
NOTA: Preparare almeno dodici provette da 1,5 mL per condizione richiesta nella Sezione
- Contrassegnare i primi 3 tubi per condizione. Avranno il volume totale di lisati cellulari ottenuto nel passaggio 6.4.
- Segna una A in 3 tubi per condizione. Questi tubi avranno i primi surnatanti ottenuti dopo la lisi e la filatura dei lisati cellulari, passaggio 7.2.
- Contrassegnare una B in 3 tubi per condizione. Questi tubi avranno una piccola aliquota dei primi surnatanti. Questi lisati serviranno come campioni di Western blot nel passaggio 7.3.
- Segnare una C in 3 tubi per condizione. Queste provette avranno i surnatanti ottenuti dopo il pull-down con NeutrAvidin, passaggio 7.7.
nota: Questo è importante nel caso in cui il Western blot non abbia mostrato alcun segnale per le proteine, il che significa che le proteine non sono state abbassate o sono andate perse in una fase della procedura. Se questa fosse la situazione, ripeti il processo per abbattere le proteine.
4. Trattamento cellulare con i BCPP
- Aspirare il terreno di coltura.
- Sostituire il volume corrispondente di terreno fresco necessario per incubare i BCPP nel volume di terreno più piccolo possibile in base ai tempi di incubazione. È molto importante che, in ogni caso, il terreno copra completamente l'intera superficie della piastra/pallone in modo che le cellule non si secchino, ad esempio 6 mL per 150 cm2 per un'incubazione di 30 minuti.
- Aggiungere il volume della soluzione madre di BCPP alle colture cellulari per raggiungere la concentrazione che si è dimostrata efficace. In questo studio, è stato dimostrato che 50 μM TAT-Cx43266-283-B riduce la proliferazione delle GSC.
- Pertanto, aggiungere 92,8 μL di 2 mg/mL di TAT-Cx43266-283-B (MW=3723,34 g/mol) per mL di terreno di coltura per ottenere una concentrazione finale di 50 μM TAT-Cx43266-283-B. Se il volume da aggiungere è diverso per i peptidi di controllo, completare con il terreno di coltura fino allo stesso volume finale. Ad esempio, sono stati aggiunti 49,1 μL TAT-B (MW=1914,31 g/mol) più 43,7 μL di terreno GSC per mL di terreno di coltura per ottenere una concentrazione finale di 50 μM TAT-B.
- Posizionare le cellule nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2 per 30 minuti per assicurarsi che avvengano le interazioni tra il BCPP e i suoi partner intracellulari. Se l'interazione richiede più tempo, incubare per tempi più lunghi o regolare i tempi nel caso in cui l'esperimento consistesse in un andamento temporale. Inoltre, l'interazione di interesse può essere promossa o prevenuta stimolando diverse vie di segnalazione intracellulare.
5. Buffer e soluzioni
- Preparare PBS pH 7,4: 136 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 7,8 mM Na2HPO4·2H2O; 1,7 mM KH2PO4.
- Preparare il tampone per la lisi delle proteine: 20 mM di Tris-HCl (pH 8,0), 137 mM di NaCl, IGEPAL all'1%, Prima dell'uso, aggiungere quanto segue: 1/100 (v/v) di cocktail di inibitori della proteasi, 1 mM di fluoruro di sodio, 1 mM di fenilmetansulfonilfluoruro (PMSF) e 0,1 mM di ortovanadato di sodio.
- Preparare il tampone Laemmli: (4x: 0,18 M Tris-HCl pH 6,8; 5 M glicerolo; 3,7 % SDS (p/v); 0,6 M β-mercaptoetanolo o 9 mM DTT; 0,04 % (v/v) blu di bromofenolo (BB)].
6. Estrazione delle proteine
NOTA: L'estrazione delle proteine è stata eseguita come descritto in precedenza. Eseguire l'intera sezione della procedura a 4 °C.
- Aspirare completamente il terreno di coltura.
- Lavare 3 x 10 mL con soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS) per 150 cm2 con molta attenzione per evitare il distacco delle cellule.
- Per ottenere il lisato cellulare, aggiungere 3 mL di tampone di lisi per 150 cm2 e raschiare accuratamente la superficie utilizzando un raschietto cellulare. Inclinando la piastra/pallone a circa 45 gradi sarà più facile raccogliere i lisati cellulari nelle provette corrispondenti.
- Versare 1 mL di lisato cellulare per provetta in tre provette da 1,5 mL. Queste provette saranno contrassegnate con la condizione e la replica come indicato al punto 3.1.
7. Discesa
- Centrifugare le provette da 1,5 mL a 11.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Trasferire i surnatanti in nuove provette (A).
- Prelevare un'aliquota di questo surnatante per condizione in diverse provette (B), cioè 50 μl per provetta. Aggiungere 4 tamponi Laemmli (16,6 μl per 50 μl di lisato) e congelare a -20 °C. Questi lisati serviranno come i soliti campioni di Western blot.
- Omogeneizzare molto bene l'agarosio NeutrAvidin agitando delicatamente. Tagliare le punte dei puntali delle pipette per aumentarne il diametro e migliorare il pipettaggio delle perline. Aggiungere 50 μL di NeutrAvidin Agarosio per mL di lisato cellulare nelle provette (A).
- Incubare a 4 °C per una notte agitando molto delicatamente per consentire a NeutrAvidin di interagire con i BCPP legati ai loro partner intracellulari.
- Centrifugare a 3.000 x g per 1 min a 4 °C per raccogliere il complesso di NeutrAvidin con le proteine.
- Rimuovere con cautela i surnatanti e trasferirli in provette pulite (C). Conservali per usarli nel caso in cui il pull-down non vada a buon fine.
- Fasi di lavaggio: aggiungere un nuovo tampone di lisi ai pellet (tubi A), risospendere per inversione e ripetere i passaggi 7.6 e 7.7 altre cinque volte. Tutti questi surnatanti possono essere scartati.
- Rimuovere i surnatanti e aggiungere 2 tamponi Laemmli al volume finale desiderato (40 μl per provetta da 1,5 mL per pellet ottenuti da palloni da cm2 di celle confluenti).
- Eluire a 100 °C per 5 minuti per dissociare le interazioni tra le proteine e centrifugare per 30 s a 8.200 x g per pellettare le perle di Neutravidina.
- Prendi i surnatanti, contenenti le proteine dissociate, con le punte dei capillari in nuove provette (D). Le perle possono essere conservate nel caso in cui sia necessario ripetere le fasi di eluizione.
nota: I surnatanti (tubi D) sono ora pronti per essere caricati in Western blot o per essere congelati a -20 °C.
