1. Trasformazione del lievito
- Raccogliere il lievito per centrifugazione (in provette da 50 ml) a 1.500 x g per 5 minuti a RT. Scartare il surnatante, risospendere ogni pellet in 5 ml di H2O sterile e riunire insieme.
- Ricentrifugare a 1.500 x g per 5 minuti a RT ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet di lievito in 1 ml di 1x LiAc/TE.
appena preparato
nota: Utilizzare cellule di lievito competenti entro 1 ora dalla preparazione.
- Preparare campioni di plasmidi (in provette da 1,5 ml) aggiungendo 200 ng di DNA plasmidico per singole trasformazioni, o 0,5 - 1 μg di DNA plasmidico per le co-trasformazioni e 100 μg di DNA portatore dei testicoli di aringhe (bollito per 20 minuti e raffreddato con ghiaccio appena prima dell'uso).
NOTA: Includere un controllo positivo, ad esempio lievito co-trasformato con pVA3 (che codifica per la fusione GAL4 DNA-BD con la proteina p53) e pTD1 (che codifica per la fusione GAL4 AD con l'antigene SV40 large T).
- Aggiungere 100 μl della sospensione di lievito competente appena preparata e 600 μl di 1 soluzione di LiAc/PEG (8 ml di PEG 3350, 1 ml di TE madre, 1 ml di LiAc madre) e agitare per ~30 secondi. Incubare a 30 °C per 30 minuti agitando a 200 giri/min.
- Aggiungere 80 μl di dimetilsolfossido (concentrazione finale del 10% v/v) e mescolare bene per inversione delicata. Shock termico per 15 minuti a bagnomaria a 42 °C mescolando ogni 2 - 3 minuti.
- Raffreddare la sospensione cellulare su ghiaccio per 2 minuti e centrifugare a 14.000 x g per 15 secondi a RT per recuperare il lievito.
- Risospendere il pellet cellulare in 100 μl di 1x TE e la piastra su piastre di terreno SD minimo appropriate per la crescita selettiva (terreno privo di leucina e triptofano per mantenere la pressione selettiva sia sull'esca che sui plasmidi bersaglio).
- Incubare le piastre capovolte a 30 °C fino a quando le colonie hanno un diametro di ~2 mm (di solito 4 - 5 giorni). Le piastre possono essere conservate a 4 °C per 2 - 3 settimane; per una conservazione più lunga fare scorte di glicerolo e conservare a -80 °C.
nota: Verificare che le proteine esca e bersaglio siano espresse nel lievito mediante immunoblotting e che non abbiano un'attivazione autonoma del gene reporter quando espresse separatamente nel lievito.
- Aggiungere 100 μl della sospensione di lievito competente appena preparata e 600 μl di 1 soluzione di LiAc/PEG (8 ml di PEG 3350, 1 ml di TE madre, 1 ml di LiAc madre) e agitare per ~30 secondi. Incubare a 30 °C per 30 minuti agitando a 200 giri/min.
- Aggiungere 80 μl di dimetilsolfossido (concentrazione finale del 10% v/v) e mescolare bene per inversione delicata. Shock termico per 15 minuti a bagnomaria a 42 °C mescolando ogni 2 - 3 minuti.
- Raffreddare la sospensione cellulare su ghiaccio per 2 minuti e centrifugare a 14.000 x g per 15 secondi a RT per recuperare il lievito.
- Risospendere il pellet cellulare in 100 μl di 1x TE e la piastra su piastre di terreno SD minimo appropriate per la crescita selettiva (terreno privo di leucina e triptofano per mantenere la pressione selettiva sia sull'esca che sui plasmidi bersaglio).
- Incubare le piastre capovolte a 30 °C fino a quando le colonie hanno un diametro di ~2 mm (di solito 4 - 5 giorni). Le piastre possono essere conservate a 4 °C per 2 - 3 settimane; per una conservazione più lunga fare scorte di glicerolo e conservare a -80 °C.
NOTA: Verificare che le proteine esca e bersaglio siano espresse nel lievito mediante immunoblotting e che non abbiano un'attivazione autonoma del gene reporter quando espresse separatamente nel lievito.
2. Saggio di carta da filtro β-Gal
per colonie
- Preparare i seguenti buffer:
- Preparare un tampone Z contenente 100 mM di Na2HPO4, 40 mM di NaH2PO4, 10 mM di KCl e 1 mM di MgSO4; regolare il pH a 7,4. Sterilizzare in autoclave e conservare presso RT.
- Preparare il tampone X-Gal sciogliendo il 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside a 20 mg/ml in N,N-dimetilformammide e conservare al buio a -20 °C. Preparare la soluzione di tampone Z/X-Gal. Preparare il tampone prima dell'uso mescolando X-Gal a 0,33 mg/ml e β-mercaptoetanolo allo 0,27% v/v nel tampone Z. Utilizzare 2,5 ml per campione.
- Aggiungere 2,5 ml di soluzione di tampone Z/X-Gal appena preparata su una piastra pulita da 100 mm e posizionarla all'interno di una carta da filtro di cellulosa.
- Posizionare una nuova carta da filtro sulla superficie della piastra con le colonie di lievito da analizzare. Strofinare delicatamente la carta da filtro sulla piastra con una pinza e lasciare agire per ~5 minuti affinché le colonie si attacchino.
nota: Processare il controllo positivo in parallelo, cioè il lievito co-trasformato con pVA3 e pTD1.
- Sollevare la carta da filtro e immergerla (con una pinza) in una pozza di azoto liquido per 30 secondi (l'azoto liquido deve essere maneggiato con cura; indossare sempre guanti spessi e occhiali). Lasciare scongelare la carta da filtro congelata a RT per ~2 min.
- Posizionare la carta da filtro (con la colonia rivolta verso l'alto) sopra la carta da filtro pre-imbevuta all'interno della piastra da 100 mm e incubare a 30 °C.
- Controllare periodicamente (ogni ~30 minuti) la comparsa di colonie blu.
nota: Esca debole: le interazioni con il bersaglio possono richiedere diverse ore per produrre un segnale blu positivo (evitare un'incubazione prolungata (>8 ore) che potrebbe dare risultati falsi positivi). Per ottenere i migliori risultati, utilizzare colonie appena co-trasformate, cioè coltivate a 30 °C per 4 - 5 giorni, ~2 mm di diametro.
