1. Celle di placcatura
- Un giorno prima della trasfezione, piastra 3,5 x 106 cellule HEK293T in 10 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con il 10% (v/v) di siero fetale bovino (FBS) e l'1% (v/v) di penicillina/streptomicina (10.000 U/ml di brodo) per piatto da 100 mm. Piastra 3 - 5 100 mm2 piastre per esperimento/condizione per garantire un sufficiente recupero delle proteine.
nota: Il numero di piastre deve essere determinato per ogni esperimento/condizione, che si baserà sui livelli di espressione e sulla solubilità del complesso proteico di interesse. In alternativa, se è necessaria una purificazione su larga scala, le linee cellulari possono essere adattate per crescere in sospensioni in fiasche rotanti, ma questo metodo non funzionerà per le trasfezioni transitorie.
2. Trasfettare le cellule o indurre linee cellulari stabili
- Il giorno seguente, controllare le cellule al microscopio. Le celle devono essere confluenti al 70-80% prima di procedere.
- Trasfettare le cellule con una miscela totale di 7 μg di DNA plasmidico e 21 μl di reagente di trasfezione per piatto da 100 mm. Trasfettare le cellule con un vettore che esprime GFP (Tabella 1) come controllo per l'efficienza della trasfezione.
nota: Se si utilizza un HEK293-T-REx o una linea cellulare stabile simile che induce l'espressione di due o più subunità complesse in risposta alla doxiciclina, l'induttore dovrà essere aggiunto alle cellule e incubato per 48 ore. Allo stesso modo, ai fini della validazione sarebbe necessaria anche una linea cellulare stabile che induca l'espressione di GFP dopo l'aggiunta dell'induttore. Procedere al passaggio 2.7.
- Preparare la miscela di trasfezione per piatto da 100 mm. In una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml, miscelare 500 μl di DMEM non integrato con 7 μg di DNA plasmidico totale (corrispondente a due o più plasmidi). In una provetta da microcentrifuga separata, miscelare 500 μl di DMEM non integrato con 21 μl di reagente di trasfezione. Ripetere per ogni reazione di trasfezione.
- Pipettare la soluzione del reagente di trasfezione nella soluzione di DNA plasmidico (non mescolare le soluzioni nell'ordine inverso). Miscelare pipettando almeno 4 volte.
- Incubare questa miscela a temperatura ambiente per 10 - 15 minuti, ma non più di 15 minuti.
- Inclinare la piastra per creare un serbatoio del terreno e pipettare con cura la miscela di trasfezione goccia a goccia sul lato interno della piastra senza disturbare le cellule. Rimettere il piatto nella sua posizione originale piatta e agitare delicatamente per distribuire il composto.
- Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore per colture cellulari umidificato con il 5% di CO2 (questa condizione è di seguito denominata "incubatore per colture tissutali"). Sostituire il supporto 5 ore dopo la trasfezione (opzionale).
3. Controllo dell'efficienza della trasfezione o dell'induzione
- A 24 ore dalla trasfezione, visualizzare le cellule al microscopio a fluorescenza per verificare l'efficienza della trasfezione (o l'induzione di una linea cellulare stabile HEK293T-REx di controllo che esprime GFP). Incubare per altre 24 ore.
4. Purificazione di Affinità STREP (STREPP AP)
- Raccolta delle cellule
- A 48 ore dalla trasfezione, rimuovere il terreno e aggiungere 8 ml di soluzione salina fredda 1x tamponata con fosfato (PBS). Pipettare su e giù per staccare le cellule dalla piastra.
- Raccogliere e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare le cellule verso il basso a 800 x g per 4 minuti a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante PBS. Ripetere la centrifuga (800 x g per 1 min a 4 °C) per eliminare eventuali residui di PBS. Conservare il pellet cellulare a -80 °C per un uso futuro o seguire la procedura seguente per continuare la purificazione delle proteine.
- Lisi delle cellule
- Risospendere i pellet cellulari utilizzando il 5× volume del pellet cellulare (~250 μl per piastra) di tampone di lisi passiva (PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, compressa cocktail di inibitori della proteasi, glicerolo 5% v/v e NP-40% 1,0%) e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
- Agitare brevemente la sospensione e il nutato per 30 minuti a 4 °C.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 10.000 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Trasferire i lisati solubili in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml ed eliminare i pellet cellulari. Conservare il 10% del volume finale del lisato solubile come "STREP AP Input". Conservare a 4 °C.
- Equilibrare le perle STREP
nota: Usa le perline STREP per il primo passaggio AP! I complessi tirati verso il basso con le perle STREP recuperano significativamente più proteine rispetto a quelli tirati giù con le perle FLAG.
- Prelevare (n × 40 μl) + n μl del 50% di impasto perlato STREP (n = numero di campioni) e centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a 4 °C.
NOTA: Utilizzare puntali a bocca larga per pipettare le perline.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 μl di PLB alle perline. Nutare la miscela di perle per 5 minuti a 4 °C. Centrifugare a 1,500 x g per 2 minuti a 4 °C.
- Ripetere per un totale di 3 lavaggi. Risospendere le perle in PLB fino a un volume finale di n × 40 μl.
- Aggiungere 40 μl di impasto liquido di perle STREP al 50% a ciascun campione di lisato cellulare e nutato per 2 ore a 4 °C.
- STREP AP
- Centrifugare la soluzione a 1,500 x g per 2 minuti a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante e conservarlo come "STREP AP Flow-through (FT)" a 4 °C.
- Aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio STREP AP I (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5% glicerolo e 0,2% NP-40) alle perle. Nutare la miscela di perle per 5 minuti a 4 °C e centrifugare a 1,500 x g per 2 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante.
- Ripetere per un totale di 4 lavaggi.
nota: Prima del quarto lavaggio, trasferire la soluzione di perle in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml per ridurre lo sfondo proteico. Questo passaggio è essenziale.
- Aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl e 1 mM EDTA) e bilanciare le microsfere capovolgendo le provette. Centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
- Eluire la proteina di interesse con 50 μl di tampone di eluizione STREP (100 mM di Tris-HCl pH 8,0, 150 mM di NaCl, 1 mM di EDTA e 2,5 mM di destiobiotina). Vortice a 800 giri/min per 15 minuti a 4 °C.
- Centrifugare le perline a 1.500 x g per 1 minuto a 4 °C. Raccogliere il surnatante. Questa frazione corrisponde al campione "STREP AP Eluition".
- Conservare la frazione delle perle a 4 °C per una seconda eluizione, che potrebbe produrre fino alla metà della quantità di proteine ottenuta con la prima eluizione. Aliquotare il 10% dell'eluizione STREP AP per la colorazione dell'argento e/o il western blotting.
- Equilibrare le perline FLAG
- Prelevare (n x 16 μl) + n μl di soluzione di perle FLAG (n = numero di campioni) e centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a 4 °C.
nota: Utilizzare puntali a bocca larga per pipettare le perline.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio FLAG (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA e 0.1% NP-40) alle microsfere. Centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a 4 °C. Ripetere per un totale di 3 lavaggi.
- Risospendere le perle nel tampone di lavaggio FLAG fino a un volume finale di n x 16 μl.
- Aggiungere 16 μl di liquame di perle FLAG alla restante eluizione STREP AP e nuttare per una notte a 4 °C.
5. FLAG IP
- Centrifugare la sospensione FLAG beads a 1.500 x g per 2 min a 4 °C. Conservare il surnatante e conservarlo come "FLAG IP Flow-through" (FT) a 4 °C.
- Aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio FLAG alla soluzione. Nutare per 5 minuti a 4 °C e centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a 4 °C. Ripetere per un totale di 4 lavaggi e rimuovere il surnatante dopo ogni lavaggio.
nota: Prima del quarto lavaggio, trasferire la soluzione di microsfere proteiche in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml per ridurre lo sfondo. Questo passaggio è essenziale.
- Rimuovere il surnatante dalla centrifuga finale e aggiungere 30 μl di tampone di lavaggio FLAG contenente 200 ng/μl di peptide FLAG nelle microsfere. Vortice a 800 giri/min per 2 ore a 4 °C.
- Centrifugare la sospensione a 1.500 x g per 2 minuti a 4 °C. Raccogliere il surnatante e conservarlo a 4 °C come "FLAG IP Eluition"
nota: I campioni di eluizione possono essere confermati mediante colorazione d'argento e/o western blot utilizzando protocolli standard e sono pronti per ulteriori saggi proteici. Quando si imposta un western blot, eseguire tutti i seguenti esempi: (1) STREP AP Input, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elution, (4) FLAG IP FT e (5) FLAG IP Eluition. I volumi caricati dovranno essere determinati per ogni esperimento. Tutti i campioni e le perle raccolti possono essere conservati a 4 °C per la conservazione a breve termine e a -80 °C per la conservazione a lungo termine. I campioni di TAP possono essere analizzati mediante spettrometria di massa per verificare l'identità dei loro componenti, per identificare nuove modifiche post-traduzionali (PTM) e/o per scoprire eventuali nuove interazioni proteiche con il complesso purificato. A tale scopo, dopo aver eseguito un gel coomassie o una macchia d'argento, le bande possono essere asportate dal gel utilizzando un bisturi pulito. In precedenza sono state pubblicate diverse eccellenti recensioni che discutono i metodi di spettrometria di massa.