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Per il presente studio, una proteina di fusione CVN-small ubiquitin-like modifier (SUMO) è stata utilizzata nei saggi di immunoassorbimento enzimatico al posto di CV-N ed è adatta per i saggi basati su cellule. La proteina H3 ricombinante a lunghezza intera del virus dell'influenza A è ottenuta commercialmente (vedi Tabella dei materiali) o espressa in linee cellulari HEK293 di mammifero e cellule di insetti infettate da baculovirus secondo protocolli standard. La proteina spike di Wuhan-1 è espressa nelle cellule HEK293 dei mammiferi. La sintesi del peptide mon-mannosilato (MM) e del peptide di-mannosilato (DM) consente la rilevazione di ligandi omogenei per CVN2 e piccole molecole mono-mannosilate.
1. Creazione di costrutti CV-N
- Per ciascuna delle varianti CVN2 e della proteina CVN2L0 (PDB ID 3S3Y), ottenere il costrutto genico con una sequenza leader pelB N-terminale e His-tag nel vettore pET27b(+) da fonti commerciali (vedi Tabella 1).
- Ottenere CVN2L0 e le relative varianti (V2, V3, V4 e V5; Figura 1A,C) sullo sfondo di un gene stampo CVN2L0 costituito da due sequenze di DNA distinte per ogni ripetizione CV-N.
- Sciogliere il DNA plasmidico liofilizzato in acqua distillata deionizzata sterile (ddH2O) a una concentrazione finale di 100 ng/μL.
2. Preparazione di piastre LB-agar con cellule trasformate in DNA plasmidico
- Preparare il terreno di coltura LB-Lennox sciogliendo 10 g/L di peptone, 5 g/L di estratto di lievito e 5 g/L di NaCl in ddH2O (vedere la Tabella dei materiali) e regolare il pH a 7,4. Eseguire la trasformazione in E. coli competente BL21 (DE3) per ogni variante (V2-V5) con metodo chimico a seguito di un rapporto precedentemente pubblicato.
- Dividere la soluzione (900 μl e 100 μl), trasferire 100 μl su piastre di agar LB (50 μg/ml di kanamicina) e utilizzare delicatamente uno spandiconcime di cellule sterile. Incubare le piastre di agar per una notte a 37 °C.
3. Clonazione
- Subclonare il gene per CV-N nei siti NdeI e BamHI di pET11a (vedi Tabella dei materiali) per la trasformazione (elettroporazione) in cellule elettrocompetenti seguendo il riferimento.
4. Mutagenesi sito-specifica
- Generare CVN2L0 e CVN-E41A mutante sullo sfondo di un gene stampo CVN2L0 contenente due sequenze di DNA distinte per ogni ripetizione CV-N.
- Effettuare le mutazioni utilizzando un kit di mutagenesi sito-specifica (vedi Tabella dei materiali) e specifici primer mutageni 5'-gagaaccgtcaacgtttggataacagagttcagg-3' e 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' per eseguire la PCR.
- Avviare una serie di reazioni del campione utilizzando concentrazioni multiple di modello di DNA a doppio filamento (dsDNA) che vanno da 5 a 50 ng (ad esempio, 5, 10, 20 e 50 ng di modello di dsDNA). Mantenere costante la concentrazione del primer.
nota: La miscela PCR e il protocollo di ciclo termico sono generalmente utilizzati come descritto nel manuale di istruzioni del kit di mutagenesi sito-specifica.
- Aggiungere l'enzima di restrizione DpnI (1 μL, 10 U/μL, vedere la Tabella dei materiali) sotto la sovrapposizione di olio minerale. Mescolare accuratamente e delicatamente le reazioni, centrifugare in una microcentrifuga da tavolo per 1 minuto e incubare immediatamente a 37 °C per 1 ora per digerire il dsDNA superavvolto dai genitori.
5. Trasformazione delle cellule batteriche
- Scongelare delicatamente le celle supercompetenti XL1-Blue (vedi Tabella dei materiali) sul ghiaccio. Per trasformare ogni controllo e reazione del campione, aliquotare le cellule supercompetenti (50 μl) in una provetta prerefrigerata in polipropilene a fondo tondo (14 mL).
- Trasferire 1 μL di DNA a filamento singolo (ssDNA) trattato con Dpn I da ciascuna reazione di controllo e campione (ssDNA mutato) per separare le aliquote delle cellule supercompetenti, che sintetizzano il filamento complementare. Agitare accuratamente le reazioni di trasformazione per mescolare e incubare le reazioni sul ghiaccio per 30 min.
nota: Prima di trasferire il DNA trattato con Dpn I alla reazione di trasformazione, si consiglia di rimuovere con cura l'olio minerale rimanente dal puntale della pipetta. Come controllo opzionale, l'efficienza di trasformazione delle cellule supercompetenti XL1-Blue deve essere verificata mescolando 0,1 ng/μL del plasmide di controllo pUC18 (1 μL) con un'aliquota di 50 μL delle cellule supercompetenti.
- Applicare l'impulso di calore alle reazioni di trasformazione a 42 °C per 45 s, quindi porre le reazioni sul ghiaccio per 2 min.
nota: L'impulso di calore applicato è già stato ottimizzato per le condizioni menzionate in provette in polipropilene a fondo tondo (14 mL).
- Aggiungere 0,5 mL di brodo NZY+ (contenente per litro: 10 g di NZ ammina (idrolizzato di caseina), 5 g di estratto di lievito, 5 g di NaCl, 12,5 mL di 1 M MgCl2, 12,5 mL di 1 M MgSO4, 10 mL di glucosio 2 M, pH 7,5 e preriscaldato a 42 °C) e incubare le reazioni di trasformazione a 37 °C con agitazione a 225-250 giri/min per 1 ora. Piastra il volume corretto di ogni reazione di trasformazione (5 μL dalla trasformazione del plasmide di controllo; 250 μL dalla trasformazione del campione) su piastre di agar LB-ampicillina.
nota: Per i controlli della trasformazione e la mutagenesi, diffondere le cellule su piastre di agar LB-ampicillina contenenti 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside (X-gal, 80 μg/mL) e isopropil-1-tio-β-D-galattopiranoside (IPTG, 20 mM) (vedi Tabella dei materiali). Inoculare 50 ml di colture cellulari con una singola colonia di cellule trasformate di E. coli per purificare il DNA plasmidico mutato per le analisi. La mutagenesi è confermata dal sequenziamento del DNA presso una struttura esterna.
6. Espressione e purificazione delle proteine
- Per una coltura su larga scala, inoculare una piccola quantità di LB (contenente ampicillina) con una singola colonia dalla piastra trasformata.
- Utilizzando la coltura notturna, inoculare la coltura di espressione con additivi, come 10 mM di MgCl2, 10 mM di MgSO4 e 20 mM di glucosio, diluendo la coltura del seme a 1/100.
- Far crescere le cellule con agitazione vigorosa a 37 °C. Far crescere le cellule a un Abs 600 nm tra 0,4 e 0,6 (fase mid-log) prima di raffreddare le cellule a 20 °C. Indurre con 1 mM di IPTG e crescere durante la notte.
- Quindi, raccogliere le cellule centrifugando a 4.000 x g per 15 minuti a 4 °C e scartare il surnatante con una pipetta.
- Risospendere il pellet di cella in tampone salino tamponato con fosfato (PBS) e centrifugare nuovamente a 4.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Quindi, scartare il surnatante con una pipetta. Risospendere il pellet rimanente in 10 mL di tampone di lisi e incubare la sospensione per 1 ora a 37 °C.
nota: Composizione del tampone di lisi: (50 mM di NaH2PO4, 300 mM di NaCl, 2% Triton-X 100, 500 ng/mL di lisozima, 1 mM di fluoruro di fenilmetilsulfonile (PMSF), 1 mM di ditiotreitolo, 1 mM di MgCl2, pH 8, vedi Tabella dei materiali).
- Sottoporre la miscela a due cicli di gelo-disgelo (-80 °C). Separare le frazioni solubili e insolubili mediante centrifugazione a 4.000 x g per 15 minuti a 4 °C e analizzarle utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE), in particolare il sodio dodecil solfato (SDS)-PAGE (Figura 1B, C).
nota: Le cellule possono essere lisate in diversi modi, come il congelamento-disgelo, la sonicazione, l'omogeneizzazione, la lisi enzimatica o una combinazione di questi metodi. La purificazione dai corpi di inclusione è consigliata per raccogliere elevate rese proteiche.
- Purificare le proteine utilizzando la cromatografia su colonna Ni-NTA (vedere la Tabella dei materiali). Caricare la frazione solubile su una colonna di microsfere di Ni-NTA rigenerata (1 mL/min). Lavare il sistema con tampone TBS (50 mM di Tris, 150 mM di cloruro di sodio, pH 7,5) prima di iniziare un gradiente (0-100% 500 mM di imidazolo in TBS per 60 min) e raccogliere le frazioni (1 mL/min). Dializzare le proteine purificate per la caratterizzazione biochimica rispetto a 100 mM di PBS (Figura 1C, D).
- In alternativa, utilizzare il gel di affinità His-Select Ni2+ (vedere la Tabella dei materiali) in provette da 14 mL per legare e risospendere il CV-N espresso in modo ricombinante marcato con His in soluzioni tampone con 20 mM di imidazolo e 250 mM di imidazolo, rispettivamente. Incubare in batch per almeno 30 min.
nota: Applicare queste proteine semi-purificate a una colonna preimpaccata monouso per lo scambio di tamponi e la purificazione di campioni biologici, ad esempio carboidrati e proteine, che possono caricare 1-1,5 mL di eluato dalla cromatografia di affinità con metalli immobilizzati.
- Trasferire le soluzioni proteiche in provette da centrifugazione con un filtro cut-off da 10 kDa (vedere la tabella dei materiali) e concentrarle centrifugando per 10 minuti a 4.500 x g e 4 °C. Per le misure SPR, sostituire le soluzioni dell'analita con 10 mM di HEPES, 150 mM di cloruro di sodio, 3 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e 0,05% di Tween20, pH 7,4 (HBS-EP(+), vedere la Tabella dei materiali).
- Aggiungere questo tampone di funzionamento SPR a un fattore di diluizione di 1:10 e centrifugare quattro volte fino al volume iniziale per 10 minuti a 4.500 x g e 4 °C.
- Determinare la concentrazione proteica a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis NanoDrop (vedere la Tabella dei materiali) in base al coefficiente di estinzione calcolato (20.440 M-1 cm-1) per la proteina principale CVN2L0 che mostra una dimensione di 23.474 Da. Utilizzare PBS (100 mM, pH 7.0) o tampone SPR come bianco e misurare la concentrazione proteica in tre fasi di diluizione (1:1, 1:10 e 1:100).
7. Spettroscopia SPR
- Utilizzare il sistema SPR a doppio canale (vedere la tabella dei materiali) con tampone in esecuzione HBS-EP(+) e 10 mM di glicina HCl pH 1,5-1,6 come tampone di rigenerazione. Accendere lo strumento, il degasatore, l'autocampionatore e la pompa e lavare l'intero sistema con ddH20 per 1 ora. Mettere il tampone di corsa pronto all'uso in un flacone separato.
- Far cadere l'olio da immersione sul rivelatore e montare un chip sensore in vetro (vedi Tabella dei materiali) rivestito con una sottile pellicola d'oro e sul lato superiore funzionalizzato con idrogel di carbossimetildestrano direttamente sul rivelatore sotto la cella di flusso a tre porte. Correggi l'impostazione tirando verso il basso il comando handling.
nota: C19RBDHC30M idrogel di destrano derivatizzato carbossimetildestricina da 200 nm con una densità media di proteina biotinilata della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus-2, è un chipchip sensore pronto all'uso con il ligando pre-immobilizzato.
8. Saggio di legame SPR per il legame CV-N a HA, proteina S e RBD
- Immobilizzare i ligandi proteici sui chip del sensore seguendo i passaggi seguenti.
- Aprire una tabella di esecuzione facendo clic su Modulo nella barra dei menu e su Esegui editor tabella nel software SPRAutoLink integrato (vedere Tabella dei materiali). Scegli e fai clic su BASIC_Immobilization dall'elenco delle tabelle di esecuzione disponibili e segui i passaggi della procedura sperimentale sullo schermo del computer. Il rispettivo editor di campioni utilizzato è mostrato nell'angolo in alto a destra.
- Fare clic su Editor set di campioni nella sezione Modulo per compilare l'elenco dei reagenti per due rack posizionati nell'autocampionatore per ulteriori analisi. Fare clic su Controllo diretto dell'autocampionatore come "Strumento" nella barra dei menu per portare i rack in avanti o a casa. Scegliere 4 °C come temperatura di esercizio.
nota: Il software SPR consente il "Controllo diretto dello strumento SPR" e il "Controllo diretto della pompa" selezionando gli strumenti corrispondenti, nonché la gestione dell'autocampionatore e facendo clic su Modulo; è possibile scegliere anche Esegui editor tabella, Grafico dati o Post-elaborazione per eseguire l'analisi dei dati. I file vengono salvati direttamente nella directory predefinita ed esportati come scrubber.files dalla finestra Post-Elaborazione.
- Avviare la pompa per infondere ddH20 facendo clic su Strumenti e controllo diretto della pompa e registrare i dati facendo clic su SPR Instrument Direct Control e ogni volta Avvia nelle nuove finestre visualizzate. Mettere i reagenti di accoppiamento (passaggio 8.3) in fiale da 300 μL, inserirli nei rack dell'autocampionatore e avviare la tabella di esecuzione facendo clic su Run.
nota: Le superfici dei chip sono condizionate con 10 mM di tampone glicina a pH 9,0 o possono essere state lavate con 1 M di cloruro di sodio, 0,1 M di borato di sodio a pH 9,0 per condizionare la superficie del chip derivatizzato carbossilico per la miscela di attivazione EDC/NHS.
- Per questa semplice interazione proteina-proteina, utilizzare il chip CMD500D (vedi Tabella dei materiali) per generare un'unità di indice di micro-rifrazione (μRIU) = 2500 - 3000 cella di flusso con HA immobilizzato e μRIU = 400 cella di flusso con proteina spike. A una velocità di flusso di infusione di 15 μL/min, iniettare una miscela acquosa e uniforme di 0,4 M di N-etil-N'-(dimetilamminopropil) carbodiimmide cloridrato (EDC*HCl) e 0,1 M di N-idrossisuccinimide (NHS) applicando i seguenti passaggi sequenziali.
- Riempire la pompa a 25.000 μl/min, eseguire la regolazione della linea di base per 30 s, iniettare 90 μl di soluzione di attivazione del campione (EDC/NHS) in un tempo di contatto di 6 minuti, quindi tenere premuto per altri 5 minuti.
- Ripetere questo ciclo dopo l'esecuzione basale per 1 minuto a 10 μL/min solo sulla cella di flusso sinistra (blu) per iniettare e immobilizzare peptidi sintetizzati chimicamente, HA e proteina spike a 20 μg/mL e consentire il successivo aggiustamento della linea di base con ddH2O per 1,5 minuti prima di spegnere la superficie del chip attivato con 1 M di etanolammina HCl pH 8,5.
- Commutare le provette dal campionatore di liquidi al degasatore da ddH20 nella bottiglia con HBS-EP(+) (Figura 2).
- Analizza i sensori SPR.
- Per eseguire studi cinetici, utilizzare varie concentrazioni di analiti (10-5-10-8 M), con una fase di rigenerazione dopo ogni iniezione e misurazioni in bianco dopo diversi analiti. Modificare la velocità di flusso a 10 μl/min e avviare le iniezioni per un tempo di contatto di 4 minuti, quindi 5 minuti per la generazione di base e due fasi di rigenerazione di 2 minuti ciascuna con un intervallo di 30 s.
- Iniettare la soluzione tampone per misure in bianco i cui sensorigrammi vengono sottratti dai campioni per normalizzare le diverse concentrazioni proteiche.
- Fare clic su Modulo, scorrere verso il basso e passare a "Post-elaborazione" facendo clic su questa modalità operativa. Fare clic su Aggiungi per selezionare le curve di legame generate nel tempo nel Data Plot Form per ogni cella di flusso ed esportare la sovrapposizione come file di scrubber (.ovr). Fare clic su File per aprire le opzioni di salvataggio dei file. Ottenere curve di risposta allineando le curve sinistra e destra e sottraendo i segnali del secondo canale di riferimento da quelli del canale del ligando.
nota: I dati vengono operati in "Post-Processing" definendo i sensorgram in modo computazionale. Viene inserito in una sovrapposizione di sensorgrammi provenienti da celle di flusso sinistra e destra, o rappresentato come sensorgrammi dalla differenza di entrambi i canali.
- Pulire l'intera fluidica con 50-100 mM di tampone glicina pH 9,5, acqua ed etanolo al 20% prima e dopo le misurazioni di legame per rimuovere tracce di sale o qualsiasi contaminazione proteica, o più rigoroso, con SDS allo 0,5% e glicina.
nota: Per evitare danni allo strumento, si consiglia di controllare la stabilità meccanica del chip di vetro prima di reinserire la cartuccia del chip nello strumento se i chip sono stati conservati in un buffer o al 100% di umidità.
Tabella 1: Dati cinetici ottenuti dai sensorgram SPR per il legame delle varianti di legame CVN2L0 e Cys-Cys V2, V4 e V5 a HA utilizzando un modello di legame Langmuir 1:1. KD [M] = kspento/kacceso o kd/ka. Tutti i dati vengono generati a 25 °C in tampone HBS-EP(+).
| Analita | ksu [M-1*s-1] | Kspento [S-1] | KD |
| CVN2L0 | 5.1 e3 | 1.3 e-3 | 255 nM |
| V2 | 4.0 e3 | 1.1 e-3 | 275 nM |
| V4 | 1.2 e3 | 1.3 e-3 | 11 μM |
| V5 | 1.2 e3 | 5.8 e-2 | 5 μM |
