Risonanza magnetica nucleare per studiare le interazioni proteina-proteina a livello atomico

Abstract

Fonte: Winkelaar, G., et al. Misurazione delle interazioni di proteine globulari e filamentose mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e termoforesi su microscala (MST). J. Vis. Exp. (2018).

Questo video descrive la tecnica di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare per studiare le interazioni proteina-proteina tra ¹⁵proteine envoplakin wild-type e mutanti marcate con N e la proteina vimentina non marcata. L'interazione riuscita tra envoplakin wild-type e vimentina porta ad un esteso allargamento della linea e alla scomparsa dei picchi negli spettri NMR, mentre l'assenza di un'interazione tra l'envoplakin mutata e la vimentina si traduce in picchi ben risolti negli spettri NMR.

Protocollo

1. Metodi NMR

1. Preparazione del campione NMR
   1. Purificare ¹⁵proteine N marcate con tipo selvatico o R1914E E-PRD utilizzando 20 mM di Tris-HCl, 1 mM di DTT, pH 7. Le soluzioni stock proteiche di solito variano da 0,3 a 1 mM con volumi di circa 1 mL.
      nota: Le proteine possono essere concentrate a >100 μM utilizzando un dispositivo di ultrafiltrazione centrifuga MWCO da 3 kDa, 5 mL per portare la concentrazione in un intervallo adatto per la preparazione del campione.
   2. Purificare un campione di proteina VimRod non marcata utilizzando 20 mM di Tris-HCl, 1 mM di DTT, pH 7.
   3. In un volume finale di 500 μL, aggiungere la proteina E-PRD wild-type o mutante a una concentrazione finale di 100 μM, l'ossido di deuterio (D₂O) a una concentrazione finale del 10% (v/v) e il DSS (acido 4,4-dimetil-4-silapentano-1-solfonico) a una concentrazione finale di 20 μM. Portare il volume del campione a 500 μL utilizzando 20 mM di Tris-HCl, 1 mM DTT e pH 7. La preparazione rappresentativa del campione è descritta nella Tabella 1.
      nota: La risonanza 0 ppm del DSS viene utilizzata per calibrare gli spostamenti chimici di ¹H e per il riferimento indiretto degli spostamenti chimici di ¹⁵N della proteina. D₂O viene utilizzato per il segnale di blocco del deuterio per mantenere lo spettrometro in funzione a un campo magnetico netto costante.
   4. Preparare un secondo campione di E-PRD, D₂O e DSS come nel passaggio precedente e aggiungere VimRod a una concentrazione finale di 50 μM prima di portare il volume a 500 μL.
   5. Trasferire i campioni da 500 μl in provette NMR larghe 5 mm per l'esperimento.

2. Configurazione sperimentale NMR

1. Attivare il flusso d'aria con il comando di espulsione "ej"; questo farà salire il campione dal magnete. A questo punto, posizionare il campione all'interno di una rotella sopra il magnete vicino all'apertura e inserirlo con il comando "ij". Attendere che il campione si depositi all'interno del magnete prima di procedere.
2. Creare un nuovo set di dati utilizzando il comando "edc" e caricare i parametri NMR standard ¹H selezionando l'esperimento "ZGPR" (Figura 1). Compila i campi NAME, EXPNO (numero dell'esperimento) e PROCNO (numero della cartella dei dati elaborati). Selezionare il solvente nel campo "Imposta solvente" e fare clic su "Esegui 'getprosol'" per leggere la testa della sonda standard e i parametri dipendenti dal solvente (prosol).
3. Bloccare il campione al solvente deuterato, cioè D₂O, utilizzando il comando "lock" e attendere che abbia terminato lo spazzamento e raggiunga il blocco.
4. Correggere la frequenza di risonanza del magnete sintonizzando il campione utilizzando il comando di sintonizzazione automatica "atma". Monitorare la curva di oscillazione fino al completamento della sintonizzazione automatica.
5. Spessorare il campo magnetico utilizzando TOPSHIM (comando "topshim"). Lo spessore è il processo di regolazione di un campo magnetico per ottenere l'uniformità intorno al campione. È buona norma memorizzare i valori di shim con il comando "wsh" e leggerli utilizzando "rsh" prima di topshim, se si utilizzano campioni uguali o simili.
6. Regolare il guadagno del ricevitore con il comando "rga" per ottenere il massimo rapporto segnale/rumore.
7. Posizionare il centro dello spettro sull'offset di risonanza dell'acqua (o1) e impostare l'impulso protonico a 90 gradi (p1) ad alta potenza utilizzando "calibo1p1".
8. Raccogli lo spettro protonico usando il comando zero go "zg" ed elabora con "efp" che include la moltiplicazione esponenziale ("em"), il decadimento a induzione libera (FID) che incorpora l'allargamento della linea, la trasformazione di Fourier "ft" di FID e "pk" per applicare la correzione di fase.
9. Applica la correzione di fase automatica "apk" e la correzione automatica della linea di base "absn" utilizzando l'opzione polinomiale senza integrazione.
10. Creare un nuovo set di dati (come in 1.2.2) per l'esperimento SOFAST HMQC selezionando "SFHMQC3GPPH" nell'esperimento.
11. Copia P1 e O1 ottimizzati dallo spettro protonico e popola gli impulsi dipendenti da P1 utilizzando il comando "getprosol 1H p1 plw1", dove p1 è il valore P1 ottimizzato e plw1 è il livello di potenza per P1.
12. Ottimizzare la costante CNST54 per impostare l'offset per lo spostamento chimico ammidico e CNST55 per definire la larghezza di banda al fine di comprendere le regioni spettrali di interesse che consentono di ottimizzare il guadagno del ricevitore (Figura 2). Per selezionare questi parametri, estrarre il primo FID (decadimento a induzione libera) dallo spettro bidimensionale e cercare il segnale osservato per definirli. Inoltre, variare il ritardo di rilassamento (D1), il numero di scansioni (NS) e le scansioni fittizie (DS) per ottenere una sensibilità del segnale accettabile con il comando "gs", che consente a go e scan di monitorare la qualità dei dati in tempo reale.
13. Registra gli spettri utilizzando Zero Go "zg".

Tabella 1. Preparazione del campione NMR.

campione	1 mM E-PRD nel tampone A (μL)	1mM VimRod nel tampone A1 (μL)	Tampone A (μL)	200 μM DSS in D2O (μL)	Tampone B2 (μL)	Volume totale (μL)
E-PRD da solo	50	0	50	50	350	500
E-PRD + VimRod	50	50	0	50	350	500
1Tampone A: 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7
2Tampone B: 23 mM Tris-HCl, 1.14 mM DTT, pH 7

Risultati

Figura 1: Cattura della schermata dell'impostazione dell'esperimento NMR. La finestra mostrata viene utilizzata per impostare un esperimento standard per raccogliere un set di dati HSQC. I parametri dell'esperimento vengono letti accanto a Esperimento. L'esperimento ZGPR mostrato è stato scelto come esperimento iniziale per caricare i parametri protonici standard e solvente-dipendenti. La finestra Ti...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cloruro di ammonio (15N, 99%)	Laboratori isotopici di Cambridge	NLM-467	Marcatura isotopica per NMR
D2O, ossido di deuterio (D, 99,8%)	Laboratori isotopici di Cambridge	DLM-2259	Preparazione del campione NMR
DSS, sodio 2,2-dimetil-2-silapentano-5-solfonato-D6 (D,98%)	Laboratori isotopici di Cambridge	DLM-8206	Riferimento per NMR
Tubi NMR di precisione da 5 mm, lunghi 7"	SJM/Deuterotubes	BOROECO-5-7	Tubi NMR
Spettrometro NMR (14.1 Tesla)	Bruker		Acquisizione dei dati NMR
Sonda criogenica TCI 5mm z-PFG	Bruker		Acquisizione dei dati NMR
software
Bruker TopSpin 4.0.1	Bruker		Elaborazione dei dati NMR