Utilizzo del phage display per selezionare proteine con elevata affinità per una proteina target

Abstract

Source: Zhang, W., et al., Utilizzo del phage display per sviluppare modulatori varianti di ubiquitina per ligasi E3. J. Vis. (2021)

In questo video, dimostriamo la tecnica di visualizzazione dei fagi per isolare proteine pre-ingegnerizzate che esprimono proteine con un'elevata affinità per la proteina bersaglio.

Protocollo

1. Prepara la libreria dei fagi

1. Scongelare la biblioteca dei fagi con ghiaccio e diluirla fino a 100 volte la diversità della biblioteca in PBS. Ad esempio, se la diversità della libreria è 1 x 10¹⁰ e la concentrazione della libreria è 1 x 10¹³, diluire la libreria in modo che la concentrazione sia 1 x 10¹². Per le librerie qui utilizzate, diluirle 10 volte in PBS combinando 1 mL di libreria con 9 mL di PBS.
   nota: La diversità della biblioteca dovrebbe essere stata determinata durante la creazione della biblioteca e non può essere facilmente valutata altrimenti. La concentrazione della libreria può essere determinata inoculando cellule di E. coli nella fase di log intermedio (OD600 0.6 - 0.8) e placcando su LB/carb.
2. Aggiungere 1/5 di volume di PEG/NaCl. Ad esempio, per 10 mL della libreria precedentemente diluita, aggiungere 2 mL di PEG/NaCl.
3. Incubare con ghiaccio per 30 min.
4. Centrifugare a 11.000 x g per 30 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e centrifugare nuovamente per 2 minuti per eliminare il surnatante rimanente.
   nota: Mettere il tubo nel rotore con lo stesso orientamento la seconda volta in quanto è stato il primo a mantenere il pellet nello stesso posto, rendendolo così più facile da vedere.
5. Risospendere delicatamente il pellet di fago in 1 mL di PBT per proteina. Per quattro proteine, risospendere il pellet in 4 mL di PBT.
   nota: Cerca di non toccare il pellet e di non introdurre bolle d'aria.

2. Mostra il fago alla proteina bersaglio

1. Controllo opzionale: aggiungere 100 μL di libreria di fagi a ciascun pozzetto rivestito nella piastra di controllo. Incubare a temperatura ambiente (~20-25 °C) per 1 ora con agitazione orbitale a 300 giri/min e trasferire la libreria dalla piastra di controllo alla piastra target.
2. Rimuovere il tampone PB dalla piastra target e aggiungere 100 μl della libreria di fagi a ciascun pozzetto rivestito.
3. Incubare a temperatura ambiente (~20-25 °C) per 1 ora con agitazione orbitale a 300 giri/min.

3. Eluire un fago rotondo

1. Rimuovere la libreria di fagi e lavare i pozzetti rivestiti quattro volte con un tampone PT. Capovolgi la piastra e picchietta su un tovagliolo di carta per rimuovere le ultime gocce.
   nota: Se più proteine bersaglio sono rivestite su una piastra, cercare di ridurre al minimo il flusso di tutte le soluzioni successive tra i pozzetti.
2. Aggiungere 100 μl di HCl 0,1 M a ciascun pozzetto rivestito e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti con agitazione orbitale a 300 giri/min.
3. Neutralizzare il pH aggiungendo 12,5 μl di Tris-HCl 1 M (pH 11) a ciascun pozzetto rivestito.
4. Raggruppare il fago eluito da tutti gli 8 pozzetti in un'unica provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Pipettare su e giù durante il trasferimento per rendere omogenee le soluzioni e aspirare tutto il liquido dai pozzetti.
5. Aggiungere il 10% di BSA al fago eluito aggregato fino a una concentrazione finale dell'1%. Per un volume di eluizione tipico di 950 μl, aggiungere 95 μl di BSA al 10%. Conservare a 4 °C. Questo è l'output rotondo.

4. Preparazione per i successivi turni di selezione

1. Preparare una coltura di semi per la coltura dell'input fagico per il successivo ciclo di selezione come nel passaggio 1.1.
2. Rivestire la piastra per il terzo turno di selezione come al punto 1.2 con le modifiche indicate di seguito.
   1. Rivestire solo quattro pozzetti per proteina in una piastra legante a 96 pozzetti. Utilizzare metà del contenuto dei tubi "tondo 2/3" o "tondo 4/5" per il giro appropriato. Diluire il contenuto di queste provette secondo necessità, per evitare che le proteine si depositino fuori dalla soluzione.
3. Prepara l'input dei fagi per il prossimo round di selezione.
   1. Utilizzare metà dell'output rotondo per inoculare 3 mL di cellule in fase mid-log. Per un'uscita tipica di un tondo, inoculare con 500 μl di uscita.
   2. Incubare a 37 °C per 30 minuti con agitazione orbitale a 200 giri/min.
   3. Aggiungere il fago helper M13K07 a una concentrazione finale di 1 x 10¹⁰ PFU/mL.
   4. Incubare a 37 °C per 1 ora con agitazione orbitale a 200 giri/min.
   5. Trasferire tutti i 3 mL di coltura a 30 mL di 2YT/carb/kan. Coltivare durante la notte a 37 °C con agitazione orbitale a 200 giri/min.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sistema di mini provette Axygen (0,65 mL, sterile, 96/rack, 10 rack/confezione)	Fisher Scientifico	14-222-198	Articoli in plastica
Terreni di coltura disidratati BD Disco: brodo LB, mugnaio (Luria-Bertani)	Fisher Scientifico	DF0446-17-3	Preparazione delle piastre per la titolazione
Albumina sierica bovina (BSA), frazione V	BioShop Italia	ALB001	Componente buffer
Sale disodico di carbenicillina 89,0-100,5% anidro	Millipore-Sigma	C1389-5G	Coltura di cellule infettate da fagmidi
Agitatore digitale compatto per micropiastre	Fisher Scientifico	11-676-337	dispositivo
Nastro sigillante in alluminio per micropiastre Corning	Fisher Scientifico	07-200-684	Sigillatura delle scorte di glicerolo fagico
Agar disidratato	Fisher Scientifico	DF0140-01-0	Preparazione delle piastre per la titolazione
DS-11 Spettrofotometro/Fluorimetro	DeNovix	DS-11 FX+	dispositivo
Greiner Bio-One CellStar 96 pozzetti, non trattata, micropiastra con fondo a U	Fisher Scientifico	7000133	Articoli in plastica
acido cloridrico	Fisher Scientifico	A144-500	chimico
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R E. coli chimicamente competente	Fisher Scientifico	C854003	Ceppo batterico per l'infezione da fagi
Kanamicina solfato	Fisher Scientifico	AAJ1792406	Coltura di cellule infettate da fagi helper M13K07
M13KO7 fago aiutante	Biolaboratori del New England	N0315S	Permesso l'impacchettamento e la secrezione dei fagemidi
Agitatore orbitale da banco MaxQ 4000	Fisher Scientifico	11-676-076	dispositivo
Micropiastra Nunc MaxiSorp a 96 pozzetti, fondo piatto	Tecnologie per la vita	44-2404-21	Articoli in plastica
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 10X	Fisher Scientifico	BP3994	Componente tampone/mezzo di risospensione fagica
Film in poliestere per ELISA e incubazione	VWR	Codice 60941-120	Copertura delle micropiastre durante l'incubazione
Polietilenglicole 8000 (PEG)	Fisher Scientifico	BP233-1	Precipitazione dei fagi
cloruro di sodio	Millipore-Sigma	S3014	Precipitazione dei fagi
Provette di coltura sterili in plastica: Polipropilene traslucido	Fisher Scientifico	14-956-1D	Coltura di input fagici
Tetraciclina cloridrato	Fisher Scientifico	BP912-100	Coltura di cellule OmniMax di E. coli
Tris Base	Fisher Scientifico	BP1525	Soluzione neutralizzante di fagi eluiti
Triptone in polvere	Fisher Scientifico	BP1421-2	Componente del terreno di crescita cellulare
Interpolazione 20	Fisher Scientifico	BP337500	Componente buffer
Estratto di lievito	Fisher Scientifico	BP1422-2	Componente del terreno di crescita cellulare