1. FKBP12 F36V -Purificazione di Venere
- Trasformare le cellule pLysS (DE3) con vettore pET22b contenente FKBP12F36V12 umano monomerizzato e tag N-terminali His6 e mVenus (vettore disponibile su richiesta). Piastre su agar LB integrate con 50 μg/mL di ampicillina e 34 μg/mL di cloramfenicolo.
- Trasferire le colonie trasformate in coltura starter da 100 mL di LB e far crescere per 16 - 20 ore a 37 °C con agitazione.
- Diluire la coltura starter densa (OD600 >1) 1:100 in terreno LB (2 lotti da 500 mL) e far crescere per 2 - 3 ore fino a OD600 = 0,6 - 0,8 (37 °C, 200 giri/min).
- Colture fresche sul ghiaccio. Indurre con IPTG da 250 μM e crescere per 16 - 20 ore a 21 °C, 200 giri/min.
- Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 2.000 x g per 20 minuti.
- Risospendere il pellet in 40 mL di tampone IMAC A (20 mM di fosfato di sodio pH 7,5, 500 mM di NaCl, 3 mM di imidazolo, 1 mM di β-mercaptoetanolo) integrato con inibitori della proteasi privi di EDTA (1 compressa per pellet cellulare).
- Sonicare le celle (500 Watt, 20 kHz, 40% di ampiezza, 9 s accese, 11 s spente per 15 minuti) su ghiaccio e raccogliere materiale solubile mediante centrifugazione a 20.000 x g.
- Trasferire il lisato solubile in un pallone conico e aggiungere 2 mL di resina (vedi Tabella dei materiali). Incubare per 1 ora con rotazione a 105 giri/min
nota: Il nichel sefarosio può essere utilizzato anche per questa fase IMAC.
- Raccogliere la resina e lavare con 250 mL di tampone IMAC A seguito da 500 mL di tampone IMAC B (20 mM di fosfato di sodio pH 7,5, 500 mM di NaCl, 7 mM di imidazolo, 1 mM di β-mercaptoetanolo).
nota: Aumentare a 50 mM di imidazolo se si utilizza la resina di nichel sefarosio.
- Eluire la proteina marcata con His6 utilizzando il tampone IMAC C (20 mM di fosfato di sodio pH 7,5, 500 mM di NaCl, 300 mM di imidazolo, 1 mM di β-mercaptoetanolo).
- Iniettare su una colonna di esclusione dimensionale (vedere la Tabella dei materiali) bilanciata in 10 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl e 1 mM DTT. FKBP12F36V ha la sua eluizione di picco a 87,71 mL sulla colonna che abbiamo usato.
- Valutare la purezza tramite SDS-PAGE e raggruppare e concentrare secondo necessità.
2. Preparazione dell'array di piastre multipozzetto
- Scongelare il FKBP12F36V purificato (o proteina marcata di interesse) da -80 °C.
- Preparare una soluzione di 100 nM di FKBP12F36V purificato (terreno, 10 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT). Sonicare e centrifugare (centrifuga rapida di 13.000 giri/min) per prevenire la formazione di aggregati.
- Pipettare 100 - 200 μl in una camera di osservazione a 8 pozzetti con fondo in vetro.
- Aggiungere il dimerizzatore BB alle concentrazioni finali di 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 e 500 nM.
- Come riferimento, preparare una soluzione di 100 nM di mVenus da solo per valutare i potenziali effetti di aggregazione e precipitazione e recuperare un valore di luminosità per il monomero con le stesse impostazioni di acquisizione.
3. Acquisizione confocale senza calibrazione
- Avviare il sistema confocale (Figura 1). Funzionerebbe qualsiasi sistema confocale per microscopio a scansione ottica dotato di rivelatori digitali o rivelatori analogici ben caratterizzati, e in grado di mantenere un tempo di permanenza costante per ogni pixel acquisito.
- Impostare il percorso del fascio di eccitazione:
- Accendere il laser a 514 nm e impostarlo a 20 - 100 nW di potenza all'uscita dell'obiettivo (per FKBP12F36V-mVenus).
- Scegli l'obiettivo 63X1.4NA o un obiettivo a immersione in acqua con correzione a collare progettato per FCS.
- Accendere un rilevatore HyD, APD o PMT calibrato. I rivelatori in grado di contare i fotoni sono preferibili, poiché in questo caso il calcolo di S, offset e σ02 non sono necessari.
- Selezionare la finestra di emissione da 520 a 560 nm
- Impostare il foro stenopeico su 1 unità Airy per l'emissione corrispondente ~545 nm.
- Imposta la modalità di acquisizione su 16 x 16 pixel
- Impostate il tempo di permanenza dei pixel tin modo che soddisfi tframe >> TD >> tdwell, dove TD è il tempo di permanenza della proteina diffondente e tframe è la frequenza dei fotogrammi. Ciò corrispondeva all'impostazione del tempo di permanenza a ~13 μs.
nota: Alcuni produttori commerciali disponevano di scanner che non mantenevano costante il tempo di permanenza per pixel. Questa costanza è fondamentale per il funzionamento del metodo.
- Imposta la dimensione dei pixel su ~120 nm.
- Selezionare la modalità di acquisizione xyt e selezionare il numero di fotogrammi da acquisire per acquisizione e pozzetto (ad esempio 5.000).
- Se il sistema è dotato di una modalità ad alta produttività, introdurre le coordinate di ciascun pozzo e il numero di acquisizioni per pozzo per automatizzare il processo.
nota: Fare attenzione a garantire la presenza di un erogatore d'acqua se si utilizza un obiettivo ad immersione.
- Se il sistema è dotato di un sistema di perfusione, caricare la soluzione BB e programmare la perfusione in modo che inizi subito dopo il 5000° fotogramma per valutare la cinetica della dimerizzazione durante l'acquisizione, ad esempio, di 10.000 immagini.
- Aggiungere una goccia d'olio nell'obiettivo a immersione in olio/acqua se si utilizza un obiettivo a immersione in acqua di correzione a collare progettato per FCS.
- Montare la camera di osservazione a 8 pozzetti sul palco.
- Seleziona il pozzo corretto e concentrati sulla soluzione.
nota: IMPORTANTE: Evitare di mettere a fuoco vicino al vetro inferiore per evitare riflessi e dispersioni. Quando ci si concentra più a fondo sulla soluzione, scollegare l'opzione di messa a fuoco automatica.
- Avvia l'acquisizione e salva la pila di immagini risultante in formato TIFF.
4. Analisi del detrend e della luminosità utilizzando il pacchetto R nandb
- Come controllo di qualità di pre-elaborazione, utilizzare ImageJ per esaminare le immagini e recuperare il profilo di intensità, come mostrato nella Figura 2a. Questo è utile per determinare se si è verificato o meno un eccesso di fotosbiancamento. Se c'è troppo sbiancamento, i dati non sono adatti per ulteriori analisi.
nota: ImageJ può anche essere utile per convertire le immagini in TIFF da formati commerciali. Il software nandb descritto di seguito può funzionare solo con i file TIFF.
- Scarica e installa R e RStudio. È consigliabile scaricare e installare prima R, quindi RStudio.
nota: Quella che segue è una descrizione di come utilizzare il pacchetto nandb R. La conoscenza del linguaggio R non è richiesta per utilizzare nandb, tuttavia, renderà la vita più facile.
- Installare il pacchetto nandb.
- Apri RStudio e nella console, digita install.packages("nandb") e attendi l'installazione.
- Conosci nandb
- Consultare il manuale.
- Esaminare la guida RStudio integrata per varie funzioni. La funzione più probabile da utilizzare sarà l'utilizzo sarà brightness(). Visualizza il file di aiuto per questa funzione digitando ? luminosità() sulla console.
- Calcola la luminosità
- Supponiamo che uno abbia un file immagine sul desktop chiamato img001.tif (nota che 'nandb' funziona solo con i file TIFF). Si può calcolare la luminosità di quell'immagine:
b <- luminosità("~/Desktop/img001.tif", tau = "auto")
- In questo modo la luminosità dell'immagine viene assegnata alla variabile b in R. Il tau = "auto" assicura che l'immagine sia correttamente detrendizzata prima del calcolo della luminosità. La cosa più comune da fare da qui è calcolare la luminosità media o mediana dell'immagine. Si può fare questo digitando media(b) o mediana(b). Si può anche scrivere l'immagine della luminosità sul desktop usando
ijtiff::write_tif(b, "~/Desktop/whatever_img_name")
- Supponiamo che si abbia una cartella piena di immagini images_folder sul desktop e che sia necessario calcolare la luminosità di queste immagini e scrivere le immagini di luminosità come file TIFF. Quindi vedi ?brightness_folder(). Questa funzione elabora un'intera cartella tutta in una volta:
brightness_folder("~/Desktop/images_folder", tau = "auto")
Questo è particolarmente utile per coloro che hanno un software che preferiscono a R perché tutti i file vengono elaborati in un unico comando, e poi si può continuare a lavorare con le immagini TIFF di luminosità di output nel software scelto, sia esso ImageJ, Python o qualcos'altro.
