Spettroscopia di fluttuazione della fluorescenza per studiare l'omo-oligomerizzazione delle proteine

1. FKBP12 F36V -Purificazione di Venere

1. Trasformare le cellule pLysS (DE3) con vettore pET22b contenente FKBP12F36V12 umano monomerizzato e tag N-terminali His6 e mVenus (vettore disponibile su richiesta). Piastre su agar LB integrate con 50 μg/mL di ampicillina e 34 μg/mL di cloramfenicolo.
2. Trasferire le colonie trasformate in coltura starter da 100 mL di LB e far crescere per 16 - 20 ore a 37 °C con agitazione.
3. Diluire la coltura starter densa (OD600 >1) 1:100 in terreno LB (2 lotti da 500 mL) e far crescere per 2 - 3 ore fino a OD600 = 0,6 - 0,8 (37 °C, 200 giri/min).
4. Colture fresche sul ghiaccio. Indurre con IPTG da 250 μM e crescere per 16 - 20 ore a 21 °C, 200 giri/min.
5. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 2.000 x g per 20 minuti.
6. Risospendere il pellet in 40 mL di tampone IMAC A (20 mM di fosfato di sodio pH 7,5, 500 mM di NaCl, 3 mM di imidazolo, 1 mM di β-mercaptoetanolo) integrato con inibitori della proteasi privi di EDTA (1 compressa per pellet cellulare).
7. Sonicare le celle (500 Watt, 20 kHz, 40% di ampiezza, 9 s accese, 11 s spente per 15 minuti) su ghiaccio e raccogliere materiale solubile mediante centrifugazione a 20.000 x g.
8. Trasferire il lisato solubile in un pallone conico e aggiungere 2 mL di resina (vedi Tabella dei materiali). Incubare per 1 ora con rotazione a 105 giri/min
   nota: Il nichel sefarosio può essere utilizzato anche per questa fase IMAC.
9. Raccogliere la resina e lavare con 250 mL di tampone IMAC A seguito da 500 mL di tampone IMAC B (20 mM di fosfato di sodio pH 7,5, 500 mM di NaCl, 7 mM di imidazolo, 1 mM di β-mercaptoetanolo).
   nota: Aumentare a 50 mM di imidazolo se si utilizza la resina di nichel sefarosio.
10. Eluire la proteina marcata con His6 utilizzando il tampone IMAC C (20 mM di fosfato di sodio pH 7,5, 500 mM di NaCl, 300 mM di imidazolo, 1 mM di β-mercaptoetanolo).
11. Iniettare su una colonna di esclusione dimensionale (vedere la Tabella dei materiali) bilanciata in 10 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl e 1 mM DTT. FKBP12F36V ha la sua eluizione di picco a 87,71 mL sulla colonna che abbiamo usato.
12. Valutare la purezza tramite SDS-PAGE e raggruppare e concentrare secondo necessità.

2. Preparazione dell'array di piastre multipozzetto

1. Scongelare il FKBP12F36V purificato (o proteina marcata di interesse) da -80 °C.
2. Preparare una soluzione di 100 nM di FKBP12F36V purificato (terreno, 10 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT). Sonicare e centrifugare (centrifuga rapida di 13.000 giri/min) per prevenire la formazione di aggregati.
3. Pipettare 100 - 200 μl in una camera di osservazione a 8 pozzetti con fondo in vetro.
4. Aggiungere il dimerizzatore BB alle concentrazioni finali di 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 e 500 nM.
5. Come riferimento, preparare una soluzione di 100 nM di mVenus da solo per valutare i potenziali effetti di aggregazione e precipitazione e recuperare un valore di luminosità per il monomero con le stesse impostazioni di acquisizione.

3. Acquisizione confocale senza calibrazione

1. Avviare il sistema confocale (Figura 1). Funzionerebbe qualsiasi sistema confocale per microscopio a scansione ottica dotato di rivelatori digitali o rivelatori analogici ben caratterizzati, e in grado di mantenere un tempo di permanenza costante per ogni pixel acquisito.
2. Impostare il percorso del fascio di eccitazione:
   1. Accendere il laser a 514 nm e impostarlo a 20 - 100 nW di potenza all'uscita dell'obiettivo (per FKBP12F36V-mVenus).
   2. Scegli l'obiettivo 63X1.4NA o un obiettivo a immersione in acqua con correzione a collare progettato per FCS.
   3. Accendere un rilevatore HyD, APD o PMT calibrato. I rivelatori in grado di contare i fotoni sono preferibili, poiché in questo caso il calcolo di S, offset e σ₀² non sono necessari.
   4. Selezionare la finestra di emissione da 520 a 560 nm
   5. Impostare il foro stenopeico su 1 unità Airy per l'emissione corrispondente ~545 nm.
   6. Imposta la modalità di acquisizione su 16 x 16 pixel
   7. Impostate il tempo di permanenza dei pixel t_in modo che soddisfi t_frame >> T_D >> t_dwell, dove T_D è il tempo di permanenza della proteina diffondente e t_frame è la frequenza dei fotogrammi. Ciò corrispondeva all'impostazione del tempo di permanenza a ~13 μs.
      nota: Alcuni produttori commerciali disponevano di scanner che non mantenevano costante il tempo di permanenza per pixel. Questa costanza è fondamentale per il funzionamento del metodo.
   8. Imposta la dimensione dei pixel su ~120 nm.
   9. Selezionare la modalità di acquisizione xyt e selezionare il numero di fotogrammi da acquisire per acquisizione e pozzetto (ad esempio 5.000).
   10. Se il sistema è dotato di una modalità ad alta produttività, introdurre le coordinate di ciascun pozzo e il numero di acquisizioni per pozzo per automatizzare il processo.
       nota: Fare attenzione a garantire la presenza di un erogatore d'acqua se si utilizza un obiettivo ad immersione.
   11. Se il sistema è dotato di un sistema di perfusione, caricare la soluzione BB e programmare la perfusione in modo che inizi subito dopo il 5000^° fotogramma per valutare la cinetica della dimerizzazione durante l'acquisizione, ad esempio, di 10.000 immagini.
3. Aggiungere una goccia d'olio nell'obiettivo a immersione in olio/acqua se si utilizza un obiettivo a immersione in acqua di correzione a collare progettato per FCS.
4. Montare la camera di osservazione a 8 pozzetti sul palco.
5. Seleziona il pozzo corretto e concentrati sulla soluzione.
   nota: IMPORTANTE: Evitare di mettere a fuoco vicino al vetro inferiore per evitare riflessi e dispersioni. Quando ci si concentra più a fondo sulla soluzione, scollegare l'opzione di messa a fuoco automatica.
6. Avvia l'acquisizione e salva la pila di immagini risultante in formato TIFF.

4. Analisi del detrend e della luminosità utilizzando il pacchetto R nandb

1. Come controllo di qualità di pre-elaborazione, utilizzare ImageJ per esaminare le immagini e recuperare il profilo di intensità, come mostrato nella Figura 2a. Questo è utile per determinare se si è verificato o meno un eccesso di fotosbiancamento. Se c'è troppo sbiancamento, i dati non sono adatti per ulteriori analisi.
   nota: ImageJ può anche essere utile per convertire le immagini in TIFF da formati commerciali. Il software nandb descritto di seguito può funzionare solo con i file TIFF.
2. Scarica e installa R e RStudio. È consigliabile scaricare e installare prima R, quindi RStudio.
   nota: Quella che segue è una descrizione di come utilizzare il pacchetto nandb R. La conoscenza del linguaggio R non è richiesta per utilizzare nandb, tuttavia, renderà la vita più facile.
3. Installare il pacchetto nandb.
   1. Apri RStudio e nella console, digita install.packages("nandb") e attendi l'installazione.
4. Conosci nandb
   1. Consultare il manuale.
   2. Esaminare la guida RStudio integrata per varie funzioni. La funzione più probabile da utilizzare sarà l'utilizzo sarà brightness(). Visualizza il file di aiuto per questa funzione digitando ? luminosità() sulla console.
5. Calcola la luminosità
   1. Supponiamo che uno abbia un file immagine sul desktop chiamato img001.tif (nota che 'nandb' funziona solo con i file TIFF). Si può calcolare la luminosità di quell'immagine:
      b <- luminosità("~/Desktop/img001.tif", tau = "auto")
      1. In questo modo la luminosità dell'immagine viene assegnata alla variabile b in R. Il tau = "auto" assicura che l'immagine sia correttamente detrendizzata prima del calcolo della luminosità. La cosa più comune da fare da qui è calcolare la luminosità media o mediana dell'immagine. Si può fare questo digitando media(b) o mediana(b). Si può anche scrivere l'immagine della luminosità sul desktop usando
         ijtiff::write_tif(b, "~/Desktop/whatever_img_name")
   2. Supponiamo che si abbia una cartella piena di immagini images_folder sul desktop e che sia necessario calcolare la luminosità di queste immagini e scrivere le immagini di luminosità come file TIFF. Quindi vedi ?brightness_folder(). Questa funzione elabora un'intera cartella tutta in una volta:
      brightness_folder("~/Desktop/images_folder", tau = "auto")
      Questo è particolarmente utile per coloro che hanno un software che preferiscono a R perché tutti i file vengono elaborati in un unico comando, e poi si può continuare a lavorare con le immagini TIFF di luminosità di output nel software scelto, sia esso ImageJ, Python o qualcos'altro.

Figura 1. Applicazione di N&B per rilevare le transizioni monomero-dimero proteico in soluzione. (a) Percorso ottico semplificato di un microscopio a scansione laser (LSM) dotato di una sorgente laser (impostata a 514 nm nel caso di proteine marcate con mVenus) diretta (frecce blu) verso un obiettivo ad immersione (nel nostro caso un olio 63X1.4NA) che illumina una soluzione da 100 nM di soluzione FKBP12F36V-mVenus. La fluorescenza di emissione (frecce verdi) passa attraverso uno specchio dicroico ed è diretta verso un filtro passa-banda che pulisce la luce di emissione, e un foro stenopeico posto a 1 unità di Airy situata proprio prima di un rivelatore digitale puntiforme in grado di contare i fotoni. (b) Un volume confocale di illuminazione viene scansionato attraverso 16 x 16 pixel che illuminano singole molecole di FKBP12F36V-mVenus che entrano ed escono dal volume confocale di forma gaussiana producendo una serie di fluttuazioni di intensità di fluorescenza. (c) Serie di immagini acquisite nel tempo

Figura 2. Il detrending automatico è necessario per misurare con precisione una popolazione di monomeri in soluzione. (a) È stata acquisita una pila di 5000 immagini da 16 x 16 pixel come descritto nella sezione Protocollo. L'intensità del primo fotogramma è mostrata insieme al profilo di intensità medio risolto nel tempo, che mostra le fluttuazioni a lungo termine che potrebbero essere correlate allo sbiancamento e ad altri effetti di solventi e/o fotofisici. Qualunque sia la causa di queste fluttuazioni a lungo termine, esse influiscono sui calcoli della luminosità e quindi richiedono un detrending. Senza il detrend automatico, si ottiene B = 1,026, mentre dopo il detrending automatico, B = 1,005. Inoltre, viene mostrata la luminosità senza (pannelli di sinistra, seconda riga) e con (pannelli di destra, seconda riga) di filtraggio uniforme. (b) Gli stessi dati presentati al punto (a) sono stati detrendizzati e i risultati in termini di intensità e luminosità sono stati mostrati.