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1. Clonazione
- Determinare le configurazioni da clonare e scegliere un linker. Etichettare le proteine con i frammenti sull'estremità N o C come descritto di seguito in modo che non interrompano la loro corretta localizzazione. Utilizzare un linker flessibile come (GGGGS)x2.
- Marcare geneticamente le proteine di interesse per i frammenti di PAmCherry1. Come opzione, utilizzare i plasmidi di clonazione elencati nell'elenco dei materiali contenente i frammenti RN (residui di PAmCherry1 1-159) e RC (Met più residui di PAmCherry1 160-236) con sequenze MCS affiancate.
- Linearizzare i plasmidi contenenti i frammenti RN e RC con PCR inversa (o digesto di restrizione) nel punto di inserimento. I primer per la PCR inversa sono elencati nella Tabella 1. Di seguito è riportato un esempio di protocollo PCR utilizzato nel laboratorio dell'autore (vedere l'elenco dei materiali per i materiali esatti utilizzati in questo protocollo).
- Mescolare la reazione PCR, portando fino a un volume finale di 50 μl con acqua: in una provetta PCR a parete sottile, aggiungere l'acqua, 25 μl di 2x master mix, 0,5 μl ciascuno dei primer diretti e inversi (20 μM diluito stock, 0,2 μM di concentrazione finale) e 1 ng di modello. Utilizzare le seguenti condizioni di ciclo: 98 °C per 30 secondi, 30 cicli di 98 °C per 7 secondi e 68 °C per 2 minuti e un'estensione finale a 72 °C per 10 minuti.
- PCR: i geni di interesse per l'inserimento nei plasmidi linearizzati contenenti frammenti di RN e RC. Eseguire la PCR come al punto 1.2.1 con il tempo di estensione a 68 °C. Utilizzare primer con sporgenze che contengano una sequenza di linker flessibile, come GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGAGGTAAGT per (GGGGS)x2, e 15 coppie di basi di omologia alle estremità dei plasmidi RN e RC linearizzati per la ricombinazione.
nota: Le sporgenze del primer per le proteine di interesse sono presentate nella Tabella 2 se si utilizzano i primer nella Tabella 1 per linearizzare la spina dorsale del plasmide.
- Digerire la reazione PCR con Dpn1 per eliminare il modello PCR. Aggiungere 0,5 μl di Dpn1 (20 U/μl) direttamente ai 50 μl della reazione PCR. Incubare a 37 °C per 1 ora e inattivare a caldo a 80 °C per 20 min. Se il modello di sfondo persiste nei passaggi successivi, aumentare la quantità di enzimi o allungare il tempo di digestione.
- Purificare i prodotti PCR tramite una colonna di centrifuga come descritto dal produttore.
- Eseguire una reazione indipendente dalla legatura per combinare un plasmide linearizzato contenente un frammento RN o RC con il gene di interesse. Misurare la concentrazione dei prodotti PCR purificati: combinare 50 ng di plasmide linearizzato e 50 ng del gene di interesse con 1 μl di premiscela enzimatica e portare il volume totale a 5 μl con acqua deionizzata. Incubare a 50 °C per 15 minuti, mettere su ghiaccio e aggiungere 20 μl di tampone TE.
- Trasformare i plasmidi ricombinanti in batteri competenti.
- Seleziona 2-4+ (a piacere) colonie per la cultura O/N. Aggiungere 5 ml di brodo LB e 5 μl di kanamicina (50 mg/ml di brodo) in una provetta in polipropilene a fondo tondo da 14 ml e aggiungere la colonia batterica selezionata con un ciclo di inoculazione sterilizzato. Incubare a 37 °C O/N agitando a 225 giri/min.
- Congelare 1 ml di coltura O/N per il brodo di glicerolo e preparare il resto come descritto dal produttore.
- Eseguire il sequenziamento per determinare un clone valido. Se si utilizzano i plasmidi di clonazione nell'elenco dei materiali, utilizzare inneschi M13 in avanti e indietro (in reazioni separate) se necessario per ottenere la sequenza completa del costrutto di fusione. Confrontare con la sequenza prevista utilizzando uno strumento di allineamento come BLAST del National Center for Biotechnology Information (NCBI) - http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
- Trasferire i costrutti verificati in sequenza a un plasmide di espressione tramite una reazione di ricombinasi.
- Aggiungere 75 ng del plasmide di destinazione, come il pcDNA per le trasfezioni transitorie o il pLenti per il confezionamento lentivirale, e 50 ng del plasmide di clonazione ricombinante a 1 μl di premiscela enzimatica e portare il volume totale a 5 μl con acqua deionizzata. Incubare a 25 °C per 1 ora, quindi aggiungere 5 μl di tampone TE.
nota: Per l'impacchettamento lentivirale e la generazione di linee cellulari stabili, utilizzare un plasmide di destinazione diverso per ciascun costrutto, ad esempio uno con resistenza alla puromicina e l'altro con neomicina. Ciò consente una doppia selezione delle cellule trasdotte. Considerare anche il promotore per ciascuno, come il promotore costitutivo del citomegalovirus (CMV) per alti livelli di espressione, o il CMV con l'operatore TetO per l'espressione regolata dalla doxiciclina sintonizzabile.
- Trasformare 5 μl in batteri competenti e miniprep i plasmidi come nei passaggi da 1.2.6 a 1.2.8, ma utilizzando l'antibiotico appropriato (tipicamente ampicillina).
- Determinare la configurazione BiFC ottimale.
- Co-trasfettare i plasmidi di espressione nelle cellule U2OS (o nella cellula di scelta).
- Aggiungere 350 μl di DMEM privo di rosso fenolo e antibiotico, integrato con il 10% di FBS, in ciascun pozzetto di un vetrino con fondo in vetro a 8 pozzetti #1,5. Piastra circa 7,5 x 104 celle per pozzetto in modo che le celle siano circa il 70%-90% confluenti il giorno successivo.
- Il giorno dopo la piastratura, co-trasfettare i plasmidi di espressione con diverse configurazioni in ciascun pozzetto utilizzando il reagente preferito e come descritto dal produttore.
- Per ogni pozzetto, aggiungere 125 ng di ciascun plasmide di espressione in 50 μl di terreno ridotto privo di siero in una provetta da 0,6 ml e pipettare su e giù per miscelare. Aggiungere 1 μl di reagente di trasfezione al centro della provetta e direttamente nel terreno. Agitare delicatamente per mescolare e lasciare riposare la reazione per 30 minuti.
- Ridurre di circa la metà il materiale in ciascun pozzetto del vetrino della camera. Aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia ai pozzetti e agitare delicatamente per mescolare. Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2 per 24-48 ore. Cambia il supporto il giorno dopo la trasfezione.
- Immagine delle cellule su un microscopio a fluorescenza come nel Protocollo 2 a partire dal passaggio 2.1.4.<br />
nota: Il campione può essere ripreso su un microscopio a fluorescenza standard se i livelli di espressione sono elevati e la fotocamera è sufficientemente sensibile per l'emissione di fotoni relativamente bassa di PAmCherry1. Le molecole di PAmCherry1 ricostituite possono essere attivate con un set di filtri ultravioletti (405 nm) prima dell'imaging con un set di filtri di eccitazione verde (561 nm).
- Se applicabile, creare un controllo negativo, ad esempio introducendo una mutazione puntiforme in una delle proteine di interesse che interrompono l'interazione. Eseguire mutagenesi sito-specifica sul plasmide di clonaggio della proteina da mutare e della configurazione prescelta.
- Generare una linea cellulare stabile impacchettando i costrutti in particelle virali e infettando le cellule U2OS (o la linea cellulare di scelta). Considerare un sistema di espressione inducibile (tetraciclina) in modo che l'espressione possa essere indotta prima dell'imaging se l'irreversibilità prolungata di BiFC è un problema o se si desidera un'espressione sintonizzabile.
cautela: Lavorare con i virus è classificato come livello di biosicurezza 2. Sebbene le recenti generazioni di sistemi di confezionamento virale abbiano notevolmente ridotto la probabilità di produrre virus competenti per la replicazione, alcuni rischi sono ancora presenti. I riferimenti sono disponibili all'indirizzo http://www.cdc.gov/ biosafety/publications/.
- Ripetere il passaggio 1.2.10 utilizzando un vettore di destinazione lenti- o retrovirale. Aumentare la coltura O/N a 100 ml per un midiprep e una maggiore purezza dei plasmidi.
- Il giorno 1: Piastra circa 2 x 106 293T/17 celle in un piatto di 10 cm per ogni costrutto da confezionare.
- Il giorno 2: preparare una reazione di trasfezione utilizzando un reagente di trasfezione a scelta e come descritto dal produttore.
- Preparare una premiscela di plasmidi da imballaggio con concentrazioni finali di 250 ng/μl per il confezionamento dei plasmidi 1 e 2 e di 100 ng/μl per il confezionamento del plasmide 3 in acqua sterile. Aggiungere 10 μl della premiscela di plasmidi di imballaggio e 2,5 μg del plasmide target a 1 ml di terreno ridotto privo di siero in una provetta a fondo tondo in polipropilene da 5 ml e pipettare su e giù per miscelare. Aggiungere 20 μl di reagente di trasfezione al centro della provetta e direttamente nel terreno.
- Agitare delicatamente per mescolare e incubare a RT per 30 minuti. Rimuovere circa metà del terreno dalle cellule e aggiungere la miscela di trasfezione in modo goccia a goccia. Agitare delicatamente per mescolare e incubare a 37 °C e 5% di CO2. Incubare 10 ml di terreno per piastra in una provetta con il tappo allentato per l'equilibrio della temperatura e della CO2
.
- Giorno 3: Cambiare delicatamente il terreno con il terreno pre-incubato e rimettere le cellule nell'incubatore. Incubare un altro tubo di terreno con il tappo allentato. Nota: i sincizi, o la formazione di grandi cellule multinucleate, possono essere un segno che l'imballaggio sta andando bene. Tuttavia, le cellule sono in uno stato fragile e possono essere facilmente staccate. Quando si cambia il terreno, inclinare il pipettatore in modo che sia orizzontale e aggiungere il terreno in senso goccio in un bordo della piastra.
- Il giorno 4: raccogliere il virus rimuovendo il terreno con una siringa e filtrandolo attraverso un filtro con pori di 0,45 μm in una provetta pulita da 50 ml. Sostituire delicatamente il terreno con il terreno pre-incubato.
- Il giorno 5: Raccogliere nuovamente come fatto in precedenza al punto 1.5.3.3 e unire il filtrato comune nella stessa provetta da 50 ml. Aggiungere 6 ml di concentratore di virus a ciascuna provetta e mescolare. Conservare a 4 °C per almeno 24 ore fino a quando il virus precipita.
nota: A seconda della salute delle cellule, il virus può essere raccolto una terza volta.
- Concentrare il virus centrifugando a 1.500 x g per 15 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 250 μl di terreno. I virus possono essere utilizzati immediatamente per l'infezione o conservati in aliquote da 50 μl a -80 °C per un massimo di un anno.
- Piastra circa 3 x 105 cellule U2OS (o bersaglio) per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti (2 ml di DMEM con il 10% di FBS per pozzetto) per l'infezione, in modo che le cellule siano confluenti per circa il 50% al momento dell'infezione.
- Il giorno seguente, rimuovere circa metà del terreno in modo che rimanga circa 1 ml. Coinfettare con 50 μl di virus concentrato per ogni costrutto. Aggiungere 1 μl di polibrene (8 mg/ml) in ciascun pozzetto. Incubare a 37 °C e 5% CO2. Cambiare il terreno il giorno successivo e incubare per un altro giorno prima della selezione degli antibiotici.
nota: La quantità di virus da aggiungere può variare a seconda del tasso di infezione desiderato. I virus possono essere titolati utilizzando la qRT-PCR.
- Aggiungere antibiotici per selezionare le cellule infette. Pozzetti separati con cellule non infette che non hanno visto il virus sono necessari come canarini per testare l'efficacia della selezione. Incubare per 2-7 giorni, o fino al completamento della selezione.
nota: Le concentrazioni efficaci devono essere titolate inizialmente, ma in genere sono 1,0 μg/ml per la puromicina e 1,0 mg/ml per la neomicina.
- Espandi le celle in un piatto più grande di 10 cm e procedi con il Protocollo 2.
2. Imaging di celle fisse
- Preparazione di un campione per l'imaging
- Pulire un vetrino con fondo in vetro #1.5 a 8 pozzetti aggiungendo 250 μl di NaOH 1 M per almeno 1 ora e lavare accuratamente con PBS.
nota: I vetrini da camera non trattati in genere producono un segnale di fondo elevato. Inoltre, le cellule possono essere sensibili al NaOH residuo e la mancata pulizia accurata della superficie del vetro (fino a 10 lavaggi) può rendere difficile l'adesione delle cellule. Se necessario, incubare il vetrino della camera pulito con PBS O/N dopo il lavaggio. Per le linee cellulari sensibili, può essere utile una placcatura a una densità più elevata (ad esempio, al 50%-60% di confluenza iniziale).
- Piastra circa 5,5 x 104 delle cellule di espressione stabile U2OS per pozzetto in 350 μl di DMEM privo di rosso fenolo con il 10% di FBS in modo che le cellule siano sane e non eccessivamente confluenti durante l'imaging.
- Eseguire i trattamenti necessari per l'esperimento, come l'aggiunta di tetraciclina per indurre l'espressione proteica.
- Fissare le celle immediatamente prima dell'imaging.
- Prima della fissazione, preparare una soluzione fresca di paraformaldeide (PFA) - 3,7% di PFA in 1x PHEM con 0,1% di glutaraldeide (GA). Per 10 ml di soluzione di PFA, pesare 0,37 g di PFA e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Aggiungere 1 ml di acqua distillata e 30 μl di NaOH 1 M e vortex. Riscaldare a 70 °C e agitare ogni 1-2 minuti fino a quando il PFA non è completamente sciolto.
- Trasferire il PFA disciolto in una provetta conica da 15 ml e aggiungere 3,8 ml di acqua distillata, 5 ml di tampone 2x PHEM, 20 μl di glutaraldeide al 25% e vortex per mescolare. Il tampone 2x PHEM di serie è 120 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA e 16 mM MgSO4, con pH regolato a 7,0 con 10 M KOH. Questa soluzione fissativa può essere conservata a 4 °C per diversi giorni.
cautela: PFA e GA sono entrambi pericolosi. Preparare la soluzione in una cappa aspirante e indossare dispositivi di protezione adeguati quando si maneggiano entrambe le sostanze chimiche. Evitare l'inalazione o il contatto diretto con la pelle.
- Rimuovere il terreno di coltura. Lavare rapidamente con 500 μl di PBS e aggiungere 250 μl di fissativo PFA per pozzetto. Incubare le cellule per 20 minuti a RT.
- Rimuovere il fissativo PFA dal campione e aggiungere 350 μl di PBS o tampone di imaging (100 mM Tris con 30 mM di NaCl e 20 mM di MgCl2, pH 8,5) per pozzetto.
- Vorticare particelle d'oro da 100 nm per rompere gli aggregati e aggiungere 35 μl per pozzetto (diluizione finale 10x) per tracciare la deriva dello stadio durante l'imaging.
- Acquisizione di immagini
- Accendere il microscopio. Accendere i laser a 405 e 561 nm, ma a questo punto tenere chiuse le persiane (interne o esterne). Accendere la telecamera EMCCD e lasciarla raffreddare. Assicurarsi che i filtri a 561 nm siano in posizione.
- Aprire il software di acquisizione e impostare il tempo di esposizione su 100 msec e il guadagno EMCCD su 300 (intervallo 1 – 1.000).
- Aggiungere olio da immersione all'obiettivo e fissare il campione al tavolino del microscopio.
- Con un campo chiaro o il laser a 561 nm acceso (~1 kW/cm2 ), il campione viene messo a fuoco.
- Per l'imaging di Ras e di altre proteine di membrana, utilizzare un obiettivo TIRF apocromatico 60X con un'apertura numerica di 1,49 e portare il microscopio in configurazione TIRF. Regolare il laser di eccitazione in modo che sia decentrato quando si colpisce l'apertura posteriore dell'obiettivo TIRF; Ciò fa sì che il laser si flette quando raggiunge il campione. Continuare a regolare il laser fino a raggiungere l'angolo critico e il laser viene riflesso indietro. Cerca una cella da visualizzare con diverse particelle d'oro in vista. Impostare una regione di interesse che racchiuda la cella (o una regione all'interno della cella) e le particelle d'oro.
Nota: TIRF riduce la profondità di penetrazione del laser di eccitazione e riduce il segnale di fondo sfocato. Inoltre, è probabile che la correzione della deriva sia più accurata quando sono visibili più particelle d'oro.
- Se disponibile, attivare il sistema di messa a fuoco automatica per correggere la deriva del campione nella direzione z. In caso contrario, regolare manualmente la messa a fuoco durante l'acquisizione se l'immagine non è a fuoco.
- Iniziare l'acquisizione con il laser a 405 nm spento e il laser a 561 nm acceso (~1 kW/cm2) nel caso in cui si stia già verificando un'attivazione sufficiente (in genere se i livelli di espressione sono elevati). In caso contrario, accendere il laser a 405 nm alla potenza di fabbrica più bassa (0,02 mW o 0,01 W/cm2) e aumentare gradualmente (0,1 mW alla volta) secondo necessità fino a quando non ci sono diverse decine di molecole per fotogramma o in modo che le singole molecole siano ben separate.
- Man mano che l'acquisizione dei dati continua, aumentare gradualmente la potenza del laser a 405 nm per mantenere la densità dello spot approssimativamente costante. Nota: con una potenza di eccitazione inferiore a 405 nm, è già possibile attivare un po' di PAmCherry1. Man mano che queste molecole sbiancano, la popolazione di molecole di PAmCherry1 fotoattivabili rimanenti diminuisce, richiedendo un flusso di fotoni più elevato per mantenere la stessa densità di molecole che emettono fluorescenza in ciascun fotogramma.
- Continuare l'acquisizione dell'immagine fino a quando l'elevata potenza di 405 nm (2,5 – 10 W/cm2) non attiva più eventi di attivazione.
nota: Il tempo totale di acquisizione dipende dal livello di espressione e dall'efficienza della complementazione.
Tabella 1. Primer per la linearizzazione di plasmidi di clonaggio contenenti frammenti di PAmCherry1. I plasmidi di clonaggio contenenti RN e RC possono essere linearizzati con PCR inversa nel punto di inserzione all'estremità N o C dei frammenti. Le sequenze sono elencate da 5' a 3'.
| Sequenza di primer (da 5' a 3') |
| Clonaggio del plasmide per l'inserimento all'inversione N-terminale | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC |
| RN all'estremità N in avanti | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA |
| RC al capolinea N in avanti | GGCGCCCTGAAGGGCGA |
| Clonaggio del plasmide per l'inserimento al C-terminale in avanti | TAAAAGGGTGGGCGCGCC |
| RN dall'inverso C-terminale | GTCCTCGGGGTACATCCGCTC |
| RC dal capolinea C inverso | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
Tabella 2. Sporgenze per primer di geni di interesse che corrispondono ai primer della Tabella 1.
Le 15 coppie di basi di omologia per la reazione indipendente dalla legatura sono generate dalle sporgenze del primer. Inoltre, le sporgenze includono la sequenza per un linker flessibile (GGGGS)x2. La sequenza di linker flessibile può invece essere aggiunta ai primer nella Tabella 1. Le sequenze sono elencate da 5' a 3'.
| Sporgenze per i primer del gene di interesse (da 5' a 3') |
| Inserimento N-terminale RN o RC in avanti | GAGCTCGGTACCATG |
| Inserzione N-terminale RN inversa | ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCCTCGCCCTTGCTCAC |
| Inserimento del terminale N RC inverso | ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC |
| Inserimento del terminale C RN in avanti | ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| Inserimento terminale C RC in avanti | GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| Inserimento del terminale C RN o RC inverso | GCGCCCACCCTTTTA |