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1. Marcatura di SBDS-FlAsH con il colorante fluorescente FlAsH 4',5'-bis(1,3,2 ditioarsolan-2-il) fluoresceina
- Miscelare 3 nmol della proteina SBDS-FlAsH (il tag FlAsH corrisponde al motivo della tetracisteina Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys geneticamente modificato nel C-terminale della proteina SBDS ricombinante) con 3 nmol del colorante 4',5'-bis(1,3,2 ditioarsolan-2-il) fluoresceina in 5 μl di volume di tampone anisotropia (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10% di glicerolo, 5 mM β-mercaptoetanolo).
- Lasciare procedere la reazione per 8 ore a 4 °C. Dializzare il campione contro il tampone anisotropia durante la notte per rimuovere il colorante libero.
- Usa la legge di Lambert-Beer per quantificare la % di proteine etichettate. Misurare l'assorbanza a 280 nm e 508 nm in uno spettrofotometro utilizzando una cuvetta di quarzo di volume appropriato. nota: Considera i seguenti coefficienti di assorbimento molare (M-1 cm-1):
Equazione 1
- Calcola la concentrazione della proteina SBDS-FlAsH marcata utilizzando l'equazione 2.
Equazione 2
- Calcolare la concentrazione della proteina SBDS totale utilizzando l'equazione 3 sostituendo il CSBDS-FlAsH calcolato dal passaggio precedente.
Equazione 3
- Calcola la percentuale di proteina marcata usando l'equazione 4.
Equazione 4
2. Esperimenti di anisotropia a fluorescenza
NOTA: Gli esperimenti di anisotropia sono stati fatti in uno spettrofluorimetro dotato di una cassetta degli attrezzi per la polarizzazione e la raccolta dei dati è stata eseguita utilizzando il programma di anisotropia fornito nel software dell'apparecchiatura. La lunghezza d'onda di eccitazione è stata impostata a 494 nm con una larghezza di banda spettrale di 8 nm e l'emissione è stata registrata utilizzando un filtro passa-banda di 530±25 nm. Le misurazioni sono state effettuate a 25 °C in una cuvetta da 200 μl con una lunghezza del percorso di 5 mm.
- In una cuvetta a fluorescenza, posizionare 200 μl di SBDS-FlAsH da 30 nM in un tampone anisotropia e titolare 2 μl di EFL1 da 30 μM. Mescolare accuratamente e lasciare riposare la reazione per 3 minuti prima di misurare il valore di anisotropia.
- Ripetere il passaggio 2.1 fino a quando non è stato aggiunto un volume totale di 40 μl di EFL1.
3. Analisi dei dati
- Adattare i dati al modello di associazione appropriato utilizzando un algoritmo di regressione dei minimi quadrati non lineare. Le equazioni per i modelli di legame più comuni sono presentate nella Tabella 1.
- Valutare il miglior modello che descriva l'interazione tra le proteine ispezionando i residui dell'adattamento. Supporta il modello scelto con ulteriori esperimenti.
Tabella 1. Modelli comuni di legame dell'interazione proteina-proteina e le equazioni matematiche che li descrivono.
