Saggio di spostamento della mobilità elettroforetica per il rilevamento di complessi fattore di trascrizione-DNA

Abstract

Fonte: Hsieh, Y. W. et al., Un protocollo ottimizzato per il test di spostamento della mobilità elettroforetica utilizzando oligonucleotidi marcati con colorante fluorescente a infrarossi. J. Vis. (2016)

In questo video, dimostriamo il test di spostamento della mobilità elettroforetica per rilevare le interazioni proteina-DNA utilizzando sonde di DNA marcate con fluorescenza a infrarossi. Quando la proteina si lega alla sonda del DNA, forma un grande complesso che migra lentamente e appare come una banda spostata sul gel.

Protocollo

1. Reazione di legame ed elettroforesi

1. Preparare 1 mL di tampone legante 5x miscelando 50 μL di Tris-HCl 1 M, pH 7,5; 10 μL di NaCl 5 M; 200 μL di 1 M KCl, 5 μL di 1 M MgCl₂, 10 μL di 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 μL di 1 M DTT; 25 μL di 10 mg/mL BSA, e 695 μL di ddH₂O.
   nota: Il 5x Binding Buffer può essere aliquotato e conservato a -20 °C. Un altro punto da considerare è che diversi fattori di trascrizione avranno modifiche diverse al buffer di legame.
2. Subito prima di impostare le reazioni di legame, eseguire preventivamente il gel di poliacrilammide nativo al 5% in 0,5x TBE + 2,5% di glicerolo per rimuovere tutte le tracce di persolfato di ammonio a 80 V per 30 - 60 minuti, o fino a quando la corrente non varia più nel tempo.
3. Impostare la reazione di legame nel volume finale di 20 μl.
   1. Miscelare 4 μL di tampone legante 5x, 80 - 200 ng di proteina A purificata (in glicerolo al 50%, cioè SOX-2), 1 μL di sonda coniugata con colorante 0,1 μM (concentrazione finale: 5 nM) e ddH₂O.
   2. Opzionale: quando sono richiesti concorrenti di sonde a freddo, aggiungere varie concentrazioni (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, ecc.) di sonde a freddo.
   3. Opzionale: quando viene testata l'interazione tra le proteine A e B (cioè SOX-2 e LIM-4), aggiungere 80-200 ng di proteina B purificata (in glicerolo al 50%, cioè LIM-4).
   4. Facoltativo: quando si utilizza la preparazione dell'estratto nucleare e si deve convalidare il legame specifico della proteina A, aggiungere un anticorpo specifico per la proteina A (ad esempio, anti-6xHis, anti-FLAG, ecc.).
   5. Incubare a R/T al buio per 15 min.
4. Caricare tutte le reazioni di legame sul gel e far scorrere il gel a 10 V/cm alla distanza desiderata.

2. Imaging

NOTA: Il gel è stato scansionato direttamente nelle lastre di vetro con un avanzato sistema di imaging a infrarossi. Pertanto, il gel può essere ulteriormente risolto e scansionato ripetutamente (Figure 1C e 2). Per scansionare il gel è stato testato anche un sistema di imaging fluorescente nel vicino infrarosso principalmente per Western blot, ma solo l'avanzato sistema di imaging a infrarossi è stato in grado di scansionare il gel con una buona risoluzione. La metodologia descritta è specifica per un particolare software di imaging a infrarossi, sebbene possano essere utilizzati altri pacchetti software.

1. Pulire il piano di lettura dello scanner con ddH₂O e asciugarlo bene prima di eseguire la scansione. Asciugare le lastre di vetro del gel e posizionare le piastre contenenti il gel sul piano dello scanner.
2. Apri il software di imaging a infrarossi e vai alla scheda "Acquisisci". Quando la piastra più sottile (1 mm) è posizionata sul piano dello scanner, utilizzare le impostazioni di Canale: 700, Intensità: Auto, Risoluzione: 169 μm, Qualità: media e Offset messa a fuoco: 1,5 mm. Quando la piastra più spessa (3 mm) è posizionata sul piano dello scanner, utilizzare le impostazioni di Canale: 700, Intensità: Auto, Risoluzione: 84 μm, Qualità: media e Offset messa a fuoco: 3,5 mm. L'offset della messa a fuoco dipende dallo spessore della lastra di vetro.
3. Selezionare l'area occupata dal gel sullo scanner. Fare clic su "Avvia" per iniziare la scansione.

Risultati

Figura 1. fEMSA utilizzando oligonucleotidi marcati con colorante fluorescente a infrarossi. (A) Diagramma di flusso di fEMSA. (B) L'effetto del colorante blu di bromofenolo, dell'arancio G e del dI-dC (1 μg) sulla fEMSA. Sono stati utilizzati 5 nM di sonda 5'Dye-LIM-4/SOX-2. (C)fEMSA che mostra la specificità di legame di 6xHis-SOX-2^G73E al sito bersaglio SOX-2 dell'eleme...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di acrilammide/bis al 30%, 37,5:1	Bio-Rad	1610158	L'acrilammide è dannosa e tossica.
Albumina sierica bovina di grado di biologia molecolare	Biolaboratori del New England	B9000S
Oligo DNA marcati con 5'IRDye700	Tecnologie DNA integrate	Oligo DNA personalizzato	Nel manoscritto questi sono indicati come oligo di DNA marcati con colorante fluorescente 5'Dye o infrarossi. L'azienda sintetizzerà su misura 5' oligonucleotidi di DNA marcati con IRDye. Richiede una sintesi su scala minima di 100μM e la purificazione HPLC.
Cella di elettroforesi verticale Mini-PROTEAN	Bio-Rad	Codice 1658000FC	dispositivo
Sistema di imaging a infrarossi Odyssey CLx	LI-COR Biotecnologie	Sistema di imaging a infrarossi Odyssey CLx	dispositivo
Sistema di imaging Odyssey Fc	LI-COR Biotecnologie	Sistema di imaging dual-mode Odyssey Fc	dispositivo
Software Image Studio (versione 4.0)	LI-COR Biotecnologie	Software Image Studio	software
Arancione G	Sigma-Aldrich	O3756-25G	chimico
6x colorante di caricamento arancione			0,25% arancia g; 30% glicerolo
0,5x TBE			45 mM di tris-borato; 1 mM di EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH8.0
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH8,0; 1 mM EDTA
5x buffer di rilegatura			50 mM Tris-HCl, pH7,5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8,0; 5 mM DTT; 250 ug/ml BSA