Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Purificazione di cellule di oligodendrociti positivi PDGFRα dal cervello di topo (modificate rispetto ai protocolli di immunopanning precedentemente descritti)
- Preparazione di una piastra di immunopanning per la selezione cellulare PDGFRα positiva e di 2 piastre per la deplezione delle cellule endoteliali e della microglia.
nota: Si prega di notare che le piastre di Petri ma non le piastre di coltura cellulare funzionano per l'esperimento di immunopanning; Se le cellule purificate verranno utilizzate per la coltura, le fasi di immunopanning devono essere eseguite nella cabina di biosicurezza
- Rivestire una piastra Petri da 10 cm con 30 μL di IgG anti-ratto di capra in 10 mL di pH 9,5, 50 mM Tris-HCl per una notte a 4 °C. Agitare la piastra per assicurarsi che le superfici delle piastre siano uniformemente e interamente coperte dalla soluzione di rivestimento.
- Preparare la soluzione di anticorpi PDGFRα diluendo 40 μL di anticorpo anti-PDGFRα di ratto con 12 mL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) contenente lo 0,2% di BSA.
- Dopo 3 lavaggi di piastra rivestita di IgG con 10 mL di 1x DPBS ciascuna, incubare la piastra rivestita di IgG con soluzione di anticorpo PDGFRα a temperatura ambiente per 4 ore.
- Lavare la piastra rivestita di anticorpi anti-PDGFRα per ratti 3 volte con 10 mL 1x DPBS ciascuna. Aggiungere delicatamente la soluzione DPBS lungo la parete laterale della piastra e non disturbare le superfici rivestite.
- Rivestire 2 nuove piastre di Petri da 15 cm per la deplezione delle cellule endoteliali e della microglia con 20 mL di DPBS contenenti 2,3 μg/mL di lectina 1 di Banderiaea simplicifolia (BSL-1) per 2 ore.
- Lavare le piastre rivestite BSL-1 3 volte con 20 mL 1x DPBS. Aggiungere delicatamente la soluzione DPBS lungo la parete laterale delle piastre e non disturbare le superfici rivestite.
- La purificazione delle cellule del lignaggio degli oligodendrociti PDGFRα positivi è stata modificata rispetto ai metodi precedentemente pubblicati.
- Sezionare i tessuti corticali da 2 cervelli di topo postnatale del giorno 7 (P7) secondo i protocolli precedentemente pubblicati.
- Dissociare i tessuti per generare una sospensione unicellulare con un kit di dissociazione del tessuto neurale (P) secondo le istruzioni dettagliate del produttore.
- Tagliare brevemente i tessuti corticali sezionati in pezzi con un bisturi e sottoporli a digestione enzimatica a 37 °C. Dopo la digestione, dissociare manualmente i pezzi con pipette di vetro Pasteur lucidate a fuoco in una sospensione a cellula singola.
- Centrifugare la sospensione monocellulare a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente e sospendere il pellet cellulare utilizzando 15 mL di tampone immunopanning (il tampone immunopanning è DPBS con 0,02% BSA e 5 μg/mL di insulina).
- Incubare la sospensione unicellulare di 2 cervelli di topo in sequenza su 2 piastre rivestite con BSL-1 per 15 minuti a temperatura ambiente con una leggera agitazione della piastra ogni 5 minuti per garantire una migliore deplezione delle microglia e delle cellule endoteliali.
- Agitare delicatamente la piastra per raccogliere le cellule non aderenti nella sospensione cellulare e incubarle sulla piastra rivestita di anticorpi PDGFRα di ratto per 45 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo l'incubazione della sospensione cellulare sulla piastra rivestita di anticorpi PDGFRα di ratto, agitare delicatamente la piastra per raccogliere la sospensione cellulare e sciacquare la piastra 8 volte con DPBS per eliminare le cellule non aderenti. Aggiungere delicatamente la soluzione di lavaggio lungo la parete laterale della piastra e agitare la piastra più volte per eliminare le cellule non aderenti.
- Staccare le cellule dalla piastra rivestita di anticorpi PDGFRα di ratto utilizzando 4 mL di soluzione di distacco cellulare per 10 minuti a 37 °C. Agitare la piastra per rimuovere le cellule aderenti.
- Raccogliere gli OPC purificati mediante centrifugazione a 300 x g a temperatura ambiente, sospendere il pellet cellulare con 2 mL di terreno di coltura cellulare OPC e contare le cellule utilizzando il blu di tripano e un emocitometro (500 mL di terreno di coltura cellulare in terreno DMEM/F12 contenente 5 mL di soluzione di penicillina-streptomicina (P/S), 5 mL di N2, 10 mL di B27, 5 μg/mL di insulina, 0,1% BSA, 20 ng/mL di bFGF e 10 ng/mL di PDGFRα).
- Convalida della purezza degli OPC dopo l'immunopanning.
- Al fine di valutare l'arricchimento delle OPC dopo l'immunopanning, utilizzare alcune delle OPC purificate per l'estrazione dell'RNA con un'estrazione a base di tiocianato di guanidio secondo le istruzioni del produttore.
- Eseguire la qRT-PCR utilizzando una miscela master di colorante verde fluorescente per verificare l'arricchimento dell'espressione di PDGFRα nelle OPC purificate rispetto alle cellule cerebrali dissociate secondo i materiali precedentemente pubblicati.
- Inoltre, seminare alcuni OPC purificati nelle piastre da 24 pozzetti rivestite di poli-D-lisina per l'immunocolorazione con l'anticorpo anti-GN2 condroitin solfato proteoglicano (NG2) come materiali precedentemente pubblicati.
2. Preparazione ChIP a Bassa Cella e Costruzione di Librerie ChIP per il Sequenziamento ad Alto Rendimento
- Olig2 Preparazione ChIP a bassa cellula con un sistema di sonicazione disponibile in commercio e un kit ChIP a basso numero di cellule disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) seguendo le procedure standard dettagliate delle istruzioni del produttore.
- Dopo il distacco dalla piastra rivestita di anticorpi anti-PDGFRα nel ratto e la conta delle cellule con blu di tripano e un emocitometro, sono stati somministrati 20.000 OPC purificati in 1 mL di terreno di coltura cellulare OPC per ogni reazione ChIP.
- Aggiungere 27 μl di formaldeide al 36,5% per fissare la sospensione cellulare per 10 minuti a temperatura ambiente.
cautela: Si prega di notare che la formaldeide deve essere utilizzata nella cappa chimica per motivi di sicurezza.
- Interrompere il cross-linking DNA-proteina con 50 μL di glicina 2,5 M per 5 minuti a temperatura ambiente.
nota: Da questo punto in poi, tutti i passaggi devono essere eseguiti su ghiaccio o in una cella frigorifera a 4 °C.
- Lavare i pellet di cellule reticolate con 1 mL di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) ghiacciata con cocktail di inibitori della proteasi e far pellettare le cellule con una centrifuga pre-raffreddata a 300 x g a 4 °C.
- Lisi il pellet cellulare in 25 μL di tampone di lisi completo per 5 minuti su ghiaccio.
nota: Agitare la provetta per sospendere le cellule nel tampone di lisi.
- Integrare il lisato cellulare con un cocktail di inibitori della proteasi HBSS ghiacciato da 75 μL e tagliare la cromatina del lisato cellulare mediante un sistema di sonicazione pre-raffreddato con 5 cicli di 30 s ON e 30 s OFF. Sonicare sempre 6 provette insieme e assicurarsi che le provette di bilanciamento contengano 100 μL di acqua.
- Dopo la tosatura, centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante in una nuova provetta dopo la centrifugazione.
- Diluire 100 μL di cromatina tranciata con un volume uguale di tampone ChIP completo ghiacciato con l'inibitore della proteasi.
- Conservare 20 μl della cromatina tranciata diluita come campione di controllo in ingresso.
nota: Il campione di controllo in ingresso è richiesto anche per il confronto con il campione immunoprecipitato Olig2 per identificare il DNA immunoprecipitato dell'anticorpo Olig2.
- Aggiungere 1 μL di anticorpo anti-olig2 di coniglio a 180 μL di cromatina tranciata diluita e incubare il tubo di reazione su una ruota rotante a 40 giri/min per 16 ore a 4 °C.
nota: Eseguire questo passaggio in una cella frigorifera.
- Per ogni reazione ChIP, lavare 11 μL di perle rivestite di proteina magnetica A con 55 μL di tampone di lavaggio delle perle e mettere il pellet di perle in 11 μL di tampone di lavaggio delle perle dopo 2 lavaggi.
nota: Eseguire questo passaggio in una cella frigorifera.
- Per ogni reazione ChIP, aggiungere 10 μL di perle rivestite di proteina A prelavate alla provetta di reazione ChIP. Eseguire questo passaggio in una cella frigorifera.
- Incubare la provetta di reazione ChIP a 4 °C per altre 2 ore su una ruota rotante.
- Posizionare il tubo di reazione ChIP sulla griglia magnetica per 1 min.
nota: Eseguire questo passaggio in una cella frigorifera.
- Rimuovere il surnatante e non rimuovere il pellet di perline.
- Lavare il pellet di perline con 100 μl per ciascuno dei 4 tamponi di lavaggio rispettivamente per 4 minuti su una ruota rotante a 4 °C.
- Dopo i lavaggi, aggiungere 200 μl di tampone di eluizione al pellet di perline e incubare la provetta di reazione ChIP a 65 °C per 4 ore per invertire il legame incrociato proteina-DNA.
- Inoltre, aggiungere 180 μL di tampone di eluizione a 20 μL di campione di controllo in ingresso e incubare a 65 °C per 4 ore per invertire anche il legame incrociato proteina-DNA.
- Aggiungere 200 μl di miscela 25:24:1 (v/v) di fenolo, cloroformio e alcol isoamilico a ciascuna provetta di reazione ChIP.
- Agitare energicamente per 1 min e centrifugare a 13.000 x g per 15 min a temperatura ambiente. Trasferire la fase superiore in un nuovo tubo.
- Aggiungere 40 μl di soluzione di acetato di sodio 3 M, 1.000 μl di etanolo al 100% e 2 μl di precipitante di glicogeno legato covalentemente a un colorante blu a ciascuna provetta di reazione ChIP durante la notte a -20 °C.
- Centrifugare a 13.000 x g per 20 min a 4 °C.
- Scartare il surnatante, lavare con 500 μl di etanolo freddo al 70% e centrifugare a 13.000 x g per 20 minuti a 4 °C.
- Scartare il surnatante, mantenere il pellet asciutto all'aria per 10 minuti e sciogliere il pellet con 50 μL di acqua.
- Costruzione della libreria ChIP per il sequenziamento ad alto rendimento
- Pulire e concentrare il DNA ChIP con un kit di pulizia secondo le istruzioni del produttore.
- Quantificare il campione di ChIP con un pico-green secondo le istruzioni del produttore.
- Utilizzare un kit ChIP-seq per T-tailing, replicazione e tailing, commutazione ed estensione del modello, aggiunta di adattatori e amplificazione, selezione della dimensione della libreria e purificazione secondo le istruzioni del produttore.
- Dopo la denaturazione del dsDNA, defosforilare l'estremità 3' dell'ssDNA mediante fosfatasi alcalina di gambero e aggiungere una coda di poli (T) all'ssDNA mediante deossinucleotidiltransferasi terminale.
- Ricuocere il DNA Poly (dA) Primer sul modello di ssDNA per la replicazione del DNA e la commutazione del modello.
- Dopo la commutazione del modello, amplificare la libreria ChIP-seq mediante PCR con i primer diretti e inversi per l'indicizzazione.
- Selezionare la libreria ChIP-seq amplificata per PCR con frammenti che vanno da 250 a 500 bp mediante perle paramagnetiche con l'opzione 2 per la selezione della doppia dimensione.
- Esamina la qualità della libreria ChIP-seq selezionata utilizzando un dispositivo di elettroforesi microfluidica a chip capillare.