1. Microscopia a polarizzazione
- Per l'illuminazione laser a campo largo, focalizzare una linea a 638 nm di un laser a diodi continui (40 mW) sull'apertura della fibra ottica multimodale per la pulizia del raggio. Montare un polarizzatore lineare all'uscita della fibra per impostare la polarizzazione della luce laser.
- Bloccare la componente di eccitazione della luce emessa con uno specchio dicroico (cut-off 640 nm) e un filtro passa-banda (passa-banda 700/75).
- Lascia che il segnale di fluorescenza passi attraverso un divisore di fascio polarizzatore, che divide la luce emessa nelle sue componenti polarizzate perpendicolari e parallele. Quindi, focalizzare il raggio non riflesso (componente parallela) e il raggio riflesso (componente perpendicolare) con una lente acromatica di lunghezza focale di 200 mm sul chip di una telecamera EM-CCD retroilluminata (Figura 1b e 1c). Utilizzare uno specchio per regolare la direzione del raggio perpendicolare verso l'obiettivo.
2. Progettazione e test di un oligomero di DNA di riferimento marcato con fluorescenza
- Determinare la sequenza centrale del DNA di riferimento: il metodo si basa su un saggio competitivo che misura la costante di dissociazione (KD2) tra un fattore di trascrizione e un oligomero di DNA concorrente non marcato che compete per il legame con un DNA marcato in fluorescenza la cui affinità con il TF funge da riferimento (KD1). La sequenza di consenso ottenuta da altre fonti come l'impronta della DNasi o l'1-ibrido batterico può servire come punto di partenza.
nota: Come regola generale, un DNA di riferimento adatto ha una diminuzione da 3 a 7 volte dell'affinità di legame con il TF rispetto alla sequenza consenso.
- Misurare mediante HiP-FA le s KD1di 2-3 singole mutazioni provvisorie della sequenza consenso derivate nella fase precedente. Cercate di mutare le posizioni nelle sequenze di consenso che non siano troppo specifiche per evitare la completa perdita di legame.
nota: È importante che la sequenza di riferimento sia vincolata dal fattore di trascrizione di interesse (abbiamo utilizzato in questo protocollo Giant Gt), ma non troppo fortemente, in modo che i concorrenti più deboli possano superarla ad alte concentrazioni.
- Estendi il motivo principale (generalmente 8-12 paia di basi) a una lunghezza di 16 paia di basi o più aggiungendo una sequenza di fiancheggiamento simmetrico su entrambi i lati (aggiungi catene laterali per una corretta legatura). Se necessario (per domini di legame più lunghi, ad esempio), utilizzare sequenze più lunghe (fino a ~50 coppie di basi di lunghezza sono state testate con il saggio HiP-FA).
cautela: Fare attenzione a non aggiungere basi che dovrebbero creare siti di legame ectopico. Utilizzare strumenti computazionali che prevedano i siti di legame dai PWM disponibili per facilitare questo processo (ad esempio, PySite).
- Come DNA di riferimento marcato, ordinare gli oligomeri che sono marcati in fluorescenza sul filamento diretto o inverso all'estremità 3' o 5'. Utilizzare, ad esempio, Cy5, Bodipy-650 o qualsiasi altro colorante adatto a una concentrazione di 10 μM (100 μM 10x stock) in acqua e diluire gradualmente come descritto al punto 3.1.
- Preparare 500 mL di tampone legante 1x aggiungendo 33 mM di tampone fosfato di potassio (pH = 7,0), 90 mM di NaCl e 0,01% di detergente non ionico in acqua distillata. Preparare anche il tampone legante 3x, che contiene gli stessi componenti, tranne che a concentrazioni triple. Se si utilizza il tampone di legatura 3x come soluzione madre per il tampone di legatura 1x, preparare volumi > 500 mL; in caso contrario, preparare 250 mL.
nota: Questa composizione è stata ottimizzata per la stabilità del fattore di trascrizione e per prevenire la dimerizzazione della glutatione S-transferasi (GST).
- Misurare con la configurazione di microscopia descritta nella fase 1 l'FA di 200 μL di tampone legante contenente 0,8 nM di DNA di riferimento marcato in presenza di diverse quantità di TF in una piastra a 96 pozzetti per microscopia con fondo di vetro (5-6 pozzetti con diverse concentrazioni di TF) per determinare la concentrazione di TF da utilizzare. Eseguire una serie di titolazioni con quantità crescenti di TF e scegliere per il saggio la concentrazione per la quale la curva raggiunge un plateau, indicando il completo legame dell'oligomero di riferimento del DNA.
nota: La concentrazione ottimale di TF dipende dai valori delle costanti di dissociazione TF-DNA. Generalmente, i KDpiù bassi richiedono concentrazioni più basse.
3. Ricottura degli oligomeri
- Per ricuocere gli oligomeri di DNA del DNA di riferimento marcato (sequenza determinata nella fase precedente), mescolare 7 μL di una soluzione di DNA a filamento singolo marcata con colorante da 10 mM e 7 μL di una concentrazione di 10 mM del suo complemento inverso non marcato in 186 μL di acqua.
- Per le sequenze di DNA concorrenti, miscelare 20 μl di soluzioni da 100 mM (in acqua, fornite dal produttore) di DNA a filamento singolo diretto con 20 μl di 100 mM di DNA a filamento singolo inverso corrispondente per ogni singola sequenza concorrente da misurare.
- Eseguire la ricottura separatamente in un ciclatore PCR standard riscaldando le soluzioni a 70 °C per 3 minuti e diminuendo la temperatura a RT a una velocità di 0,1 K/s. Se la macchina PCR utilizzata non supporta gradienti di temperatura a quella velocità, è sufficiente eseguire incubazioni graduali con temperature decrescenti (testate sono stati 99 cicli di 3 s con -0,4 K per ciclo).
4. Preparazione del gel
NOTA: La sezione seguente spiega la preparazione di due diversi tipi di gel: 1) i pozzetti di titolazione contengono gel con proteine e vengono utilizzati per determinare i KDper le rispettive sequenze di DNA concorrenti, e 2) i pozzetti di calibrazione utilizzano NB per determinare la concentrazione di DNA in ogni dato punto temporale e altezza di acquisizione. L'attenzione si concentra sulla preparazione dell'esperimento in una piastra a 96 pozzetti, ma sono indicati anche i volumi corrispondenti per un formato di piastra a 384 pozzetti.
- Sciogliere l'agarosio allo 0,5% p/v a basso punto di fusione nel tampone legante facendolo bollire in un forno a microonde da laboratorio. Dopo la completa dissoluzione, regolare nuovamente il volume con ddH2O per compensare l'eventuale evaporazione.
nota: Per comodità, preparare una scorta di 10-20 aliquote da 10 ml di gel e scioglierle a 75°C quando sono necessarie. Le scorte di gel possono essere conservate presso RT.
cautela: Fare attenzione a non surriscaldare la soluzione in gel nel forno a microonde. Sono preferibili brevi intervalli di riscaldamento con agitazione intermedia.
- Per preparare i pozzetti di titolazione e calibrazione, fondere prima due aliquote di gel da 10 mL a 75 °C sotto agitazione.
- Utilizzare 240 μl (incluso il 20% di sovraccarico) per ogni concorrente (n = numero di sequenze di concorrenti).
- Utilizzare lo stesso volume di gel per il pozzetto di calibrazione NB per garantire una temperatura e una viscosità uguali di entrambi i gel.
- Quindi impostare la temperatura a 35 °C e attendere che la temperatura si equilibri.
- Per i pozzetti di titolazione, aggiungere 1,4 nM (concentrazione finale) di DNA di riferimento ibridato (ottenuto nella fase 3), proteina TF (concentrazione finale CTF = 20-60 nM, come determinato nella fase 2.6), DTT (0,2 mM) e tampone legante in un volume totale di n x 200 μL o n x 13 μL in un formato di piastra a 96 o 384 pozzetti, rispettivamente (più le spese generali). Mescolare accuratamente invertendo/agitando (non vortice).
- Aggiungere lentamente 200 μl per pozzetto in formato piastra a 96 pozzetti (13 μl/pozzetto per 386 pozzetti) della soluzione di gel preparata nel passaggio precedente nei pozzetti di titolazione della piastra a pozzetti.
- Per i pozzetti di calibrazione, in primo luogo, aggiungere 5 nM NB al gel fuso all'esterno dei pozzetti (il volume totale dipende dal formato della piastra dei pozzetti utilizzato e dal numero di pozzetti di calibrazione; di solito 5-6 per piastra a pozzetti sono sufficienti).
- Pipettare lentamente 200 μl (13 μl per il formato di piastra a 384 pozzetti) di gel contenente NB all'interno dei pozzetti di titolazione della piastra a pozzetti e assicurarsi di evitare bolle d'aria.
nota: L'uso di pipette elettroniche o robotica aumenta significativamente la riproducibilità.
- Lasciare solidificare il gel per 10 minuti a RT e altri 10 minuti a 4 °C (rimuovere la condensa dal bicchiere in seguito, se necessario). Assicurati di eseguire tutti questi passaggi su una superficie perfettamente orizzontale per evitare superfici in gel disomogenee.
nota: I gel contenenti proteine sono generalmente stabili per almeno diverse ore a 4 °C.
5. Aggiungere la Soluzione DNA della Concorrenza
NOTA: Le seguenti soluzioni devono essere preparate prima di iniziare la titolazione e devono essere aggiunte contemporaneamente ai pozzetti di calibrazione e titolazione.
- Aggiungere il DNA e le proteine di riferimento marcati ricotti in un tampone di legame 3x a concentrazioni 3 volte superiori rispetto alle aliquote stock del gel.
- Miscelare 20 μl della soluzione ottenuta con 40 μl di ciascuna soluzione di DNA concorrente ricotto ottenuta nella fase 3.
- Per ogni pozzetto di calibrazione, miscelare 20 μL di tampone legante 3x contenente 15 mM di soluzione NB con 40 μL di DNA concorrente ricotto (qualsiasi sequenza della stessa lunghezza è adatta).
nota: Per le piastre da 384 pozzetti, utilizzare 21 μl invece di 60 μl in totale.
- Opzionalmente, verificare l'omogeneità dei livelli di altezza del gel nei diversi pozzetti della piastra spettroscopicamente misurando l'assorbanza a 380 nm, utilizzando un lettore di piastre multipozzetto (i valori di assorbanza sono proporzionali alle altezze del gel).
- Aggiungere 50 μl (7 μl per il formato piastra a 384 pozzetti) delle soluzioni di DNA miste della concorrenza (ricotte nella fase 3) sopra i gel. Cercate di aggiungere tutte le soluzioni della concorrenza il più contemporaneamente possibile utilizzando pipette elettroniche multicanale o una testa di pipettaggio a 96 canali, se disponibile. Dopo l'aggiunta delle soluzioni della concorrenza, posizionare la piastra sul tavolino del microscopio e iniziare immediatamente le misurazioni.
6. Acquisizione di immagini
- Acquisire in sequenza serie temporali di z-stack (ad esempio, utilizzare 12 piani e 100-300 ms di tempo di illuminazione). Evitare di scattare immagini troppo vicino alla superficie del pozzetto (< ~1,4 μm con le piastre utilizzate nel presente documento) per escludere qualsiasi distorsione di polarizzazione.
- Eseguire 10-25 cicli di misurazioni fino al completo svincolo del DNA di riferimento marcato dal TF. L'endpoint viene tipicamente raggiunto dopo 1-2 ore, a seconda della cinetica di legame e della diffusività del DNA concorrente.
