Anisotropia di fluorescenza per determinare l'affinità di legame tra fattore di trascrizione e DNA

Abstract

Fonte: Jung, C. et al., Misurazione ad alta sensibilità delle affinità di legame tra fattore di trascrizione e DNA mediante titolazione competitiva mediante microscopia a fluorescenza. (2019).

Questo video descrive l'anisotropia di fluorescenza ad alte prestazioni che aiuta a monitorare l'interazione tra fattori di trascrizione e DNA. Il test monitora le interazioni di una molecola di DNA marcata con fluoroforo con il suo fattore di trascrizione specifico misurando il grado di polarizzazione dovuto alla rotazione molecolare o all'anisotropia del DNA marcato con fluoroforo.

Protocollo

1. Microscopia a polarizzazione

1. Per l'illuminazione laser a campo largo, focalizzare una linea a 638 nm di un laser a diodi continui (40 mW) sull'apertura della fibra ottica multimodale per la pulizia del raggio. Montare un polarizzatore lineare all'uscita della fibra per impostare la polarizzazione della luce laser.
2. Bloccare la componente di eccitazione della luce emessa con uno specchio dicroico (cut-off 640 nm) e un filtro passa-banda (passa-banda 700/75).
3. Lascia che il segnale di fluorescenza passi attraverso un divisore di fascio polarizzatore, che divide la luce emessa nelle sue componenti polarizzate perpendicol....

Risultati

Figura 1: Rappresentazioni schematiche del saggio HIP-FA e configurazione sperimentale. (a) Sistema di somministrazione di gel per la titolazione del DNA concorrente in pozzetti singoli. (b) Configurazione della microscopia HIP-FA. Microscopio automatizzato a campo largo personalizzato con rilevamento della luce a fluorescenza polarizzata su una telecamera EM-CCD. (c) Immagine grezza a fluorescenza c.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Oligomeri di DNA Cy5-labled 16- / 18-bp	Eurofins		Sintesi personalizzata
Oligomeri di DNA 16- / 18-bp	Eurofins		Sintesi personalizzata
Blu Nilo A	sigma	N5632-25G
Micropiastra Sensoplate plus a 96 o 384 pozzetti, PS	Greiner	655891
Piastra sensoplate a 384 pozzetti, nera	Greiner	788896
Agarosio, bassa temperatura di gelificazione	sigma	Codice A9414-50G
cloruro di sodio	Merck	Codice 1.06404.1000
Interpolazione-20	sigma	P1379-1L
Idrogenofosfato triidrato di potassio	Merck	Codice 1.05099.1000
Diidrogeno fosfato di potassio	Merck	Codice 1.04873.1000
Elemento Q-POD	Merck Millipore	ZMQSP0DE1
Filtro Millipak 40 Gamma Gold	Merck Millipore	MPGL04GK2
Sistema di purificazione dell'acqua Milli-Q Integral 3	Merck Millipore	ZRXQ003WW
Quantum TIX	Merck Millipore	QTUMOTIX1
DL-ditiotreitolo	sigma	Codice 43815-1G
Gradiente Mastercycler	Eppendorf	Z316083
Provetta SafeSeal 1,5 mL	Sarstedt	72.706.200
Provetta 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Tazza Multiply-Pro 0,2 mL PP	Sarstedt	72.737.002
CONFIGURAZIONE DELLA MICROSCOPIA:
Microscopio a campo largo automatizzato	LEICA	DMI6000
Obiettivo a lunga distanza	LEICA	HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Secco
Laser a diodi continui a linea 638 nm	omicron	PHOxX 638-40, 40mW
Telecamera EM-CCD retroilluminata	Andor	iXon DV897
Specchio dicroico	AHF	Taglio 640 nm
Filtro passa-banda	AHF	Passa-banda ET 700/75
Polarizzatore lineare	Thorlabs	LPVISC050-MP2
Divisore di fascio polarizzatore	Thorlabs	BS010
Lente acromatica	Thorlabs	Lunghezza focale 200 mm
Fibra ottica multimodale	Optronis	FVP600660710
SISTEMA ROBOTIZZATO:
Il nostro sistema robotizzato comprende una workstation Biomek NXP con testa a 96 canali e pipettatori Span-8, collegati con un servo-shuttle, che vengono utilizzati per tutte le fasi di trasferimento del liquido. Inoltre, il sistema è dotato di agitatori orbitali e di un lettore di micropiastre (Paradigm, Molecular device) servito dalla pinza Span-8	Beckman Coulter	Biomek NXP
software:
linguaggio di programmazione	Strumenti nazionali	Labview 9.0
Script per il software HiP-FA disponibile all'indirizzo			https://github.com/ GeneCenterMonaco di Baviera/HiP-FA