1. Preparazione del sistema
- Progettazione di plasmidi del sito di legame
- Progettare la cassetta del sito di rilegatura come illustrato nella Figura 1. Ogni minigene contiene le seguenti parti (da 5' a 3'): sito di restrizione Eagl, ∼40 basi dell'estremità 5' del gene di resistenza alla kanamicina (Kan), promotore pLac-Ara, sito di legame dei ribosomi (RBS), AUG del gene mCherry, uno spaziatore (δ), un sito di legame RBP, 80 basi dell'estremità 5' del gene mCherry, e un sito di restrizione ApaLI.
nota: Per aumentare il tasso di successo del saggio, progettare tre cassette per ciascun sito di legame, con distanziatori costituiti da almeno una, due e tre basi. Per ulteriori linee guida, vedere la sezione Risultati rappresentativi.
- Clonaggio di plasmidi del sito di legame
- Ordina le cassette del sito di legame come minigeni del DNA a doppio filamento (dsDNA). Ogni minigene è lungo ∼500 bp e contiene un sito di restrizione Eagl e un sito di restrizione ApaLI rispettivamente alle estremità 5' e 3' (vedi passaggio 1.1.1).
nota: In questo esperimento, sono stati ordinati mini-geni con metà del gene della kanamicina per facilitare lo screening delle colonie positive. Tuttavia, l'assemblaggio di Gibson è adatto anche in questo caso, nel qual caso il sito di legame può essere ordinato come due oligo di DNA a filamento singolo complementari più corti.
- Doppia digestione sia dei mini-geni che del vettore bersaglio con Eagl-HF e ApaLI mediante il protocollo di restrizione e purificazione della colonna.
- Legare i minigeni digeriti alla spina dorsale del sito di legame contenente il resto del gene reporter mCherry, il terminatore e un gene di resistenza alla kanamicina.
- Trasformare la soluzione di legatura in cellule TOP10 di Escherichia coli.
- Identificare i trasformanti positivi tramite il sequenziamento Sanger.
- Progettare un primer 100 basi a monte della regione di interesse (vedere la Tabella 1 per le sequenze di primer).
- Miniprep alcune colonie batteriche.
- Preparare 5 μL di una soluzione di 5 mM del primer e 10 μL di DNA a una concentrazione di 80 ng/μL.
- Inviate le due soluzioni a una struttura conveniente per il sequenziamento con metodo Sanger.
- Conservare i plasmidi purificati a -20 °C e i ceppi batterici come scorte di glicerolo, entrambi nel formato a 96 pozzetti. Il DNA sarà quindi utilizzato per la trasformazione in cellule TOP10 di E. coli contenenti uno dei quattro plasmidi RBP di fusione (vedi passaggio 1.3.5).
- Progettazione e costruzione del plasmide RBP
NOTA: Le sequenze di aminoacidi e nucleotidi delle proteine del rivestimento utilizzate in questo studio sono elencate nella Tabella 2.
- Ordinare la sequenza RBP richiesta priva di un codone di stop come minigene dsDNA ordinato su misura privo di un codone di stop con siti di restrizione alle estremità (Figura 1).
- Clonare l'RBP testato privo di un codone di stop immediatamente a valle di un promotore inducibile e a monte di una proteina fluorescente priva di codone di inizio (Figura 1), in modo simile ai passaggi 1.2.2-1.2.4. Assicurati che il plasmide RBP contenga un gene di resistenza agli antibiotici diverso rispetto al plasmide del sito di legame.
- Identificare i trasformanti positivi tramite il sequenziamento Sanger, in modo simile al passaggio 1.2.5 (vedere la Tabella 1 per le sequenze di primer).
- Scegli un trasformante positivo e rendilo chimicamente competente. Conservare come glicerolo plasmidi purificati a -20 °C e scorte di glicerolo di ceppi batterici a -80 °C in piastre a 96 pozzetti.
- Trasformare i plasmidi del sito di legame (dal passaggio 1.2.6) conservati in piastre a 96 pozzetti in cellule batteriche chimicamente competenti che contengono già un plasmide RBP-mCeruleo. Per risparmiare tempo, invece di placcare le cellule su piastre di Petri, piastrerle utilizzando un pipettatore a 8 canali su piastre a 8 corsie contenenti agar Luria-Bertani (LB) con antibiotici pertinenti (Kan e Amp). Le colonie dovrebbero apparire in 16 ore.
- Selezionare una singola colonia per ogni doppio trasformante e crescere per una notte in terreno LB con i relativi antibiotici (Kan e Amp) e conservare come riserve di glicerolo a -80 °C in piastre a 96 pozzetti.
2. Configurazione dell'esperimento
NOTA: Il protocollo qui presentato è stato eseguito utilizzando un sistema robotizzato di manipolazione dei liquidi in combinazione con un incubatore e un lettore di piastre. Ogni misurazione è stata effettuata per 24 concentrazioni di induttore, con due duplicati per ogni combinazione ceppo + induttore. Utilizzando questo sistema robotico, sono stati raccolti dati per 16 ceppi al giorno con 24 concentrazioni di induttori. Tuttavia, se tale dispositivo non è disponibile o se sono necessari meno esperimenti, questi possono essere facilmente eseguiti a mano utilizzando una multipipetta a 8 canali e adattando il protocollo di conseguenza. Ad esempio, in questo modo sono stati acquisiti i risultati preliminari per quattro ceppi al giorno con 12 concentrazioni di induttori e quattro punti temporali.
- Preparare, in anticipo, 1 L di tampone per biodosaggio (BA) mescolando 0,5 g di triptone, 0,3 mL di glicerolo, 5,8 g di NaCl, 50 mL di 1 M MgSO4, 1 mL di tampone 10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pH 7,4 e 950 mL di acqua doppia distillata (DDW). Autoclave o filtro sterile del tampone BA.
- Coltivare i ceppi a doppia trasformazione a 37 °C e 250 giri/min agitando in 1,5 mL LB con antibiotici appropriati (kanamicina a una concentrazione finale di 25 μg/mL e ampicillina a una concentrazione finale di 100 μg/mL), in piastre a 48 pozzetti, per un periodo di 18 ore (durante la notte).
- Al mattino, fare i seguenti preparativi.
- Piastra induttore. In una piastra pulita a 96 pozzetti, preparare i pozzetti con terreno semi-povero (SPM) costituito per il 95% da BA e per il 5% da LB26 nell'incubatore a 37 °C. Il numero di pozzetti corrisponde al numero desiderato di concentrazioni di induttori. Aggiungere C4-HSL ai pozzetti della piastra induttrice che conterrà la massima concentrazione dell'induttore (218 nM).
- Programmare il robot per diluire in serie il terreno da ciascuno dei pozzetti a più alta concentrazione in 23 concentrazioni inferiori che vanno da 0 a 218 nM. Il volume di diluizione di ciascun induttore dovrebbe essere sufficiente per tutti i ceppi (compresi i duplicati).
- Durante la preparazione delle diluizioni dell'induttore, scaldare 180 μL di SPM nell'incubatore a 37 °C, in piastre a 96 pozzetti.
- Diluire i ceppi notturni della fase 2.2 di un fattore 100 mediante diluizioni seriali: in primo luogo, diluire di un fattore 10 mescolando 100 μl di batteri con 900 μl di SPM in piastre a 48 pozzetti, quindi diluire nuovamente di un fattore 10 prelevando 20 μl dalla soluzione diluita in 180 μl di SPM preriscaldato, in piastre a 96 pozzetti adatte per misure fluorescenti.
- Aggiungere l'induttore diluito dalla piastra induttrice alle piastre a 96 pozzetti con i ceppi diluiti in base alle concentrazioni finali.
- Agitare le piastre a 96 pozzetti a 37 °C per 6 ore, misurando la densità ottica a 595 nm (OD595), mCherry (560 nm/612 nm) e mCerulea (460 nm/510 nm) tramite un lettore di piastre ogni 30 minuti. Ai fini della normalizzazione, misurare la crescita di SMP senza l'aggiunta di cellule.
