1. Giorno 9 (mattina): Inizia la coltura per la misurazione enzimatica.
- Risospendere la coltura e trasferire 125 μl utilizzando una pipetta multicanale su una piastra spettrofotometrica (misura OD600).
nota: Attenzione: Non erogare l'ultima goccia per evitare bolle, se l'OD600 è inferiore a 0,3 - 0,6, incubare le cellule rimanenti per 1 - 2 ore in più in base alla lettura. La coltura da 125 μl utilizzata in questa fase può essere scartata o trasferita nuovamente nel blocco di pozzetti profondi originale a discrezione dell'utente.
- Centrifugare le celle rimanenti nel blocco a pozzetti profondi per 10 minuti a 3000 x g e 21 °C. Rimuovere il surnatante capovolgendolo.
- Aggiungere 200 μl di tampone Z e vortex.
nota: Si prega di consultare la ricetta per il tampone Z nella Tabella 1.
- Centrifugare per 5 minuti a 3000 x g e 21 °C. Rimuovere il surnatante capovolgendolo.
- Aggiungere 20 μl di tampone Z e vortex.
- Coprire la piastra con una pellicola sigillante in grado di resistere ai cicli di gelo-scongelamento. Eseguire 4 cicli di congelamento/scongelamento utilizzando azoto liquido in una cappa aspirante e poi 42 ºC in un bagno d'acqua (2 minuti ciascuno).
- L'aggiunta di 200 μl di tampone Z/beta-mercaptoetanolo (β-ME)/orto-nitrofenil-β-galattoside (ONPG) (12 mL, 21 μL, 8,4 mg produrranno 20 mL di soluzione; preparare sempre fresco).
nota: L'ONPG impiegherà un po' di tempo per dissolversi correttamente, quindi prepara la soluzione un'ora prima di raggiungere questo passaggio. L'ONPG funge da substrato per la misurazione dell'attività della β-galattosidasi.
- Incubare per un massimo di 17 - 24 ore a 30 °C (controllare nel frattempo, se il colore si sviluppa prima, procedere alla fase successiva).
2. Giorno 10 (mattina): Ferma la reazione e misura.
- Aggiungere 110 μl 1M Na2CO3 per arrestare la reazione e registrare il tempo.
- Agitare e centrifugare per 10 min a 3000 x g e 21 °C.
- Prelevare 125 μL di surnatante utilizzando il multicanale e misurare OD420.
nota: Attenzione, non erogare l'ultima goccia per evitare bolle.
Tabella 1: La ricetta delle soluzioni utilizzate nel protocollo. La tabella fornisce la ricetta per le soluzioni stock e di lavoro dei principali tamponi utilizzati nel saggio.
| Tampone TE 10X (10ml) | |
| desiderabile | Dal magazzino |
| 1000mM Tris-Cl (pH 8,0) | 1 ml di Tris 1M |
| 10mM EDTA (pH 8,0) | 200uL di EDTA 0,5 M |
| Aumentare il volume con acqua | |
| TE/LiAc (10ml) | |
| desiderabile | Dal magazzino |
| 1X | 1mL TE 10X |
| 0,1 milioni di LiAc | 1 ml di LiAc 1M |
| Aumentare il volume con acqua | |
| TE/LiAc/PEG (50 mL) 50% | |
| desiderabile | Dal magazzino |
| 1X | 5 ml di TE 10X |
| 0,1 milioni di LiAc | 5 ml di LiAc 1M |
| 40 ml PEG3350 | |
| Tampone Z (1L) pH 7.0 | |
| Na2HPO4 16.1g di eptaidrato o 8.52g di anidro |
| NaH2PO4 5.5g di idrato o 4g di anidro |
| KCl 0.75g |
| MgSO4 0.246g di idrato o 0.12g di anidro |
| Mantieni il pH con HCl |
| Tutte le soluzioni vengono sterilizzate prima dell'uso. |
| Piastre di media e agar utilizzate nel protocollo (YPDA, SD-Ura; Le piastre di agar SD-Trp-Ura e SD-Trp-Ura) seguono la stessa ricetta di Y1H |
