Misurazione dell'attività dell'elicasi di una proteina bersaglio utilizzando duplex di RNA marcati con biotina

Abstract

Fonte: Yu, L. et al., Saggi biochimici in vitro che utilizzano etichette di biotina per studiare le interazioni proteina-acido nucleico. J. Vis. Exp. (2019)

In questo video, dimostriamo la procedura per determinare l'attività dell'elicasi di una proteina bersaglio per svolgere il substrato di dsRNA marcato con biotina. L'attività dell'enzima è stata identificata analizzando lo spostamento della mobilità elettroforetica, seguito da un saggio di chemiluminescenza utilizzando streptavidina coniugata con enzimi chemiluminescenti.

Protocollo

1. Preparazione delle proteine

1. Costrutti di espressione MOV10
   1. Generare costrutti di espressione del cDNA che codificano MOV10 nel topo.
      1. Impostare le reazioni di reazione a catena della polimerasi (PCR) per ogni frammento. Miscelare 1 μL di cDNA di topo (da C57BL/6 testicolo di topo), 1 μL di dNTP, 2 μL di 10 μM di primer diretto, 2 μL di 10 μM di primer inverso, 1 μL di DNA polimerasi, 25 μL di tampone PCR 2x e 18 μL di H₂O (ddH₂O) a doppia distillazione in un volume finale di 50 μL.
         nota: I primer per l'amplificazione di frammenti genici Mov10 sono elencati ....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
attrezzatura
centrifuga	Eppendorf, Germania	5242R
Sistema di imaging chemiluminescente	Tanon, Cina	5200
Sonifero digitale	Branson, Stati Uniti	BBV12081048A	450 Watt; 50/60 HZ
Tampone elettroforetico semisecco	Hoefer, Stati Uniti	TE77XP
Revolver a tubo	Crystal, Stati Uniti	3406051
Reticolante a luce UV	UVP, Stati Uniti	CL-1000
materiali
Membrana in nylon	Thermo Scientific, Stati Uniti	TG263940A
Piatto di coltura trattato TC	Corning, Stati Uniti	430167	100 millimetri
Piatto di coltura trattato TC	Corning, Stati Uniti	430597	150 millimetri
Provette per microprovette	AXYGEN, Stati Uniti	MCT-150-C	1,5 ml
Tubi	Corning, Stati Uniti	430791	15 ml
Reagenti
Perline magnetiche M2 anti-FLAG	Sigma, Stati Uniti	Codice: M8823
ATP	Thermo Scientific, Stati Uniti	591136
Kit di sviluppo del colore della fosfatasi alcalina BCIP/NBT	Beyotime, Cina	Visualizzazione del materiale C3206
CelLyticTM Reagente per lisi cellulare M	Sigma, Stati Uniti	Codice 107M4071V
Kit di clonazione in un solo passaggio ClonExpress II	Vazyme, Cina	Visualizzazione del materiale C112
Kit di rilevamento dell'acido nucleico chemiluminescente	Thermo Scientific, Stati Uniti	T1269950
dNTP	Sigma-Aldrich, Stati Uniti	DNTP100-1KT
DMEM	Gibco, Stati Uniti	10569044
Edta	Invitrogen, Stati Uniti	AM9260G	0,5 milioni
Cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA	Roche, Stati Uniti	4693132001
Kit Maxi Plasmidi EndoFree	Vazyme, Cina	DC202
Mini kit per l'estrazione del DNA in gel FastPure	Vazyme, Cina	DC301-01
FBS	Gibco, Stati Uniti	10437028
Peptide FLAG	Sigma, Stati Uniti	F4799
glicerolo	Sigma, Stati Uniti	SHBK3676
Tampone HEPES	Sigma, Stati Uniti	SLBZ2837	1 M
KOAc	Sangon Biotech, Cina	127-08-02
MgCl2	Invitrogen, Stati Uniti	AM9530G	1 M
NaCl	Invitrogen, Stati Uniti	AM9759	5 milioni
NP-40	Amresco, Stati Uniti	M158-500ML
Opti-MEM medio	Gibco, Stati Uniti	31985062
Pbs	Gibco, Stati Uniti	10010023	pH 7,4
Inibitore della RNasi	Promega, Stati Uniti	N251B
Streptavidina fosfatasi alcalina	Promega, Stati Uniti	V5591
TBE	Invitrogen, Stati Uniti	15581044
Tampone Tris-HCI	Invitrogen, Stati Uniti	15567027	1 M, pH 7,4
Tampone Tris-HCI	Invitrogen, Stati Uniti	15568025	1 M, pH 8,0
Interpolazione-20	Sangon Biotech, Cina	A600560