Misurazione dell'attività dell'elicasi di una proteina bersaglio utilizzando duplex di RNA marcati con biotina

Abstract

Fonte: Yu, L. et al., Saggi biochimici in vitro che utilizzano etichette di biotina per studiare le interazioni proteina-acido nucleico. J. Vis. Exp. (2019)

In questo video, dimostriamo la procedura per determinare l'attività dell'elicasi di una proteina bersaglio per svolgere il substrato di dsRNA marcato con biotina. L'attività dell'enzima è stata identificata analizzando lo spostamento della mobilità elettroforetica, seguito da un saggio di chemiluminescenza utilizzando streptavidina coniugata con enzimi chemiluminescenti.

Protocollo

1. Preparazione delle proteine

1. Costrutti di espressione MOV10
   1. Generare costrutti di espressione del cDNA che codificano MOV10 nel topo.
      1. Impostare le reazioni di reazione a catena della polimerasi (PCR) per ogni frammento. Miscelare 1 μL di cDNA di topo (da C57BL/6 testicolo di topo), 1 μL di dNTP, 2 μL di 10 μM di primer diretto, 2 μL di 10 μM di primer inverso, 1 μL di DNA polimerasi, 25 μL di tampone PCR 2x e 18 μL di H₂O (ddH₂O) a doppia distillazione in un volume finale di 50 μL.
         nota: I primer per l'amplificazione di frammenti genici Mov10 sono elencati nella Tabella 1.
      2. Eseguire le reazioni di PCR utilizzando i seguenti programmi: 95 °C per 5 min, 35 cicli di riscaldamento a 95 °C per 15 s, ricottura a 64 °C per 15 s, estensione a 72 °C per 20 s (2 min per l'estensione a lunghezza intera MOV10) e estensione finale a 68 °C per 7 min.
   2. Analizzare il DNA PCR amplificato mediante elettroforesi su gel, tagliare rapidamente la banda della dimensione richiesta dal gel sotto una lampada UV e posizionarla in una provetta da centrifuga.
      nota: La dimensione prevista del prodotto visibile sul gel di agarosio per MOV10 è di 3015 bp.
   3. Purificare il DNA della PCR con un kit di estrazione su gel seguendo il protocollo del produttore.
      1. Aggiungere un volume uguale di tampone di dissoluzione nella provetta da centrifuga del passaggio 1.1.2 e sciogliere il gel in un bagno d'acqua a 50-55 °C per 5-10 minuti, assicurandosi che i pezzi di gel si sciolgano completamente. Centrifugare brevemente per raccogliere eventuali goccioline dalla parete della provetta.
         nota: La concentrazione massa/volume del gel e del tampone di dissoluzione è di 1 mg/μL.
      2. Posizionare la colonna di adsorbimento nella provetta di raccolta, trasferire la soluzione contenente il frammento di gel disciolto nella colonna di adsorbimento e centrifugare a 12.000 x g per 2 minuti.
      3. Eliminare il filtrato sul fondo delle provette di raccolta. Aggiungere 600 μl di tampone di lavaggio alla colonna, centrifugare a 12.000 x g per 1 minuto ed eliminare il filtrato.
      4. Ripetere il passaggio 1.1.3.3 una volta.
      5. Riposizionare la colonna nella provetta di raccolta e centrifugare a 12.000 x g per 2 minuti per rimuovere tutto il tampone di lavaggio rimanente.
      6. Posizionare la colonna di adsorbimento in una provetta da centrifuga sterilizzata da 1,5 mL, aggiungere 50 μL di ddH₂O al centro della colonna di adsorbimento e centrifugare a 12.000 x g per 1 minuto. Misurare la concentrazione di DNA dell'eluato utilizzando uno spettrofotometro.
   4. Digestione di restrizione dei plasmidi
      1. Digerire il vettore pRK5 con BamHI e XhoI mescolando 4 μg di vettore pRK5, 5 μL di tampone digest 10x, 1 μL di BamHI e 1 μL di XhoI e ddH₂O fino a un volume di reazione finale di 50 μL. Incubare a 37 °C per 2 ore.
   5. Analizza il DNA vettore mediante elettroforesi su gel, taglia rapidamente la banda della dimensione desiderata dal gel con un bisturi sotto una lampada UV e posizionala in una provetta da centrifuga.
   6. Purificare il DNA vettoriale con un kit di estrazione su gel come 1.1.3 seguendo le istruzioni del produttore.
   7. Impostare una reazione di ligazione ricombinante standard combinando 0,03 pmol di vettore linearizzato, 0,06 pmol di frammento di cDNA, 2 μL di ligasi e 4 μL di tampone ligasi 5x e ddH₂O in un volume di reazione finale di 10 μL.
      nota: Clona MOV10 in un vettore pRK5.
   8. Incubare la miscela a 37 °C per 30 minuti, quindi raffreddare immediatamente la reazione per 5 minuti con ghiaccio. Trasforma i plasmidi ricombinanti MOV10 in batteri DH5α.
      nota: Verificare tutti i costrutti ricombinanti mediante sequenziamento Sanger.
   9. Preparare le scorte di glicerolo di colture batteriche contenenti plasmidi ricombinanti verificati aggiungendo un volume uguale del 50% di glicerolo alle colture liquide e conservando a -80 °C.
      nota: Per ogni esperimento successivo, estrarre i batteri dalle scorte di glicerolo su una piastra di agar fresca e utilizzare una singola colonia per l'espansione come descritto nel passaggio 1.2.
2. Estratti proteici MOV10 da cellule HEK293T
   1. Esprimono transitoriamente le proteine MOV10 in cellule HEK293T in coltura.
      1. Preparare il plasmide MOV10-pRK5 a una concentrazione >500 ng/μL.
      2. Seminare HEK293T celle in piatti da 15 cm. Quando la densità cellulare raggiunge ~70%-90%, sostituire il terreno di coltura cellulare con il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco fresco contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina.
      3. Per una trasfezione, diluire 60 μg di DNA plasmidico MOV10-pRK5 in 3 mL di terreno sierico ridotto, quindi aggiungere 120 μL di reagente potenziatore della trasfezione e mescolare bene.
      4. In una provetta separata, diluire 90 μL del reagente di trasfezione con 3 mL di terreno sierico ridotto (senza penicillina-streptomicina) e mescolare bene.
      5. Aggiungere il DNA diluito a ciascuna provetta di reagente di trasfezione diluito. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
      6. Aggiungere la miscela di trasfezione alla coltura cellulare e coltivare le cellule per ~36-48 ore.
   2. Dopo 36-48 ore, raccogliere le cellule da ciascuna piastra in una provetta da 50 mL. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Lavare ogni pellet con 10 mL di PBS ghiacciato e raccogliere le celle mediante centrifugazione a 500 x g per 5 minuti a 4 °C.
   3. Risospendere il pellet in 3 mL di tampone di lisi cellulare contenente un cocktail completo di inibitori della proteasi esente da acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Incubare per 30 minuti con ghiaccio. Centrifugare il lisato a 20.000 x g e 4 °C per 20 minuti.
   4. Aggiungere 100 μl di microsfere magnetiche anti-FLAG per piatto di cellule in una provetta da 1,5 mL.
   5. Lavare le microsfere magnetiche 2 volte con tampone K150 (50 mM HEPES a pH 7,5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0,1% NP-40).
      1. Risospendere le microsfere magnetiche in 1 mL di tampone K150 ghiacciato.
      2. Incubare le microsfere magnetiche per 2 minuti a 4 °C con una rotazione delicata e pellettare le microsfere magnetiche con l'aiuto di un magnete. Rimuovere ed eliminare il surnatante.
   6. Aggiungere le microsfere magnetiche al surnatante del lisato cellulare del passaggio 1.3.3 e incubare a 4 °C per 2 ore.
   7. Lavare le microsfere magnetiche legate alle proteine 3 volte con il tampone K150, poi 2 volte con K150 contenente 250 mM di NaCl, quindi 3 volte con il tampone K150 come 1,3,5.
   8. Risospendere le perle in 300 μL di tampone di eluizione FLAG (100 mM di NaCl, 20 mM di Tris-HCl a pH 7,5, 5 mM di MgCl₂, 10% di glicerolo), aggiungere il peptide FLAG a una concentrazione finale di 0,5 μg/μL e incubare con le perle su un rotatore a 4 °C per 1 ora, quindi pellettare le microsfere magnetiche con l'aiuto di un magnete.
   9. Raccogliere il surnatante che contiene le proteine MOV10 eluite, determinare la concentrazione e conservare a -80 °C per un uso futuro.

2. Preparazione dell'acido nucleico

1. Acquistate oligonucleotidi di DNA e RNA (oligo) con o senza marcature di biotina da una fonte idonea. Diluire ciascun oligo in ddH₂O senza RNasi a 20 μM e mantenerlo a -80 °C per un uso futuro.
   nota: Le sequenze oligo di substrati di DNA/RNA utilizzate in questo studio sono elencate nella Tabella 2.
2. Preparare la seguente miscela per la reazione di ricottura dell'RNA a doppio filamento (dsRNA) per il saggio di attività dell'elicasi MOV10: miscelare 60 mM di acido N-2-idrossietilpiperazina-N-etano-sulfonico (HEPES) a pH 7,5, 6 mM di KCl, 0,2 mM di MgCl₂ e ddH₂O privo di RNasi in un volume di reazione finale di 20 μL.
3. Ricottura degli oligo di RNA per formare un duplex di RNA riscaldando una miscela del filamento superiore marcato con biotina (2 μM, concentrazione finale) e 1,5 volte del suo filamento inferiore complementare non marcato nel tampone di ricottura (fase 2.2) a 95 °C per 5 minuti, quindi raffreddarlo lentamente a temperatura ambiente (RT).

3. Saggi biochimici in vitro

1. EMSA e reazioni enzimatiche
   1. Per il saggio di attività dell'elicasi MOV10, miscelare 50 mM di Tris-HCl a pH 7,5, 20 mM di KoAc, 2 mM di MgCl₂, 0,01% NP-40, 1 mM di DTT, 2 U/μL di inibitore della RNasi, 10 nM di substrato di RNA marcato con biotina, 2 mM di adenosina trifosfato (ATP), 100 nM di trappola per RNA e 20 ng di proteina MOV10 e ddH₂O in un volume di reazione finale di 20 μL. Incubare la miscela di reazione a 37 °C per 10 min, 30 minuti e 60 minuti. Aggiungi il buffer di stop 5x per fermare la reazione.
      nota: Trappola per RNA, un oligo non marcato con biotina con sequenza, complementarità all'oligo marcato, che impedisce al dsRNA srotolato di ricuocere nuovamente.
2. Gel di poliacrilammide
   1. Lavare le piastre di gel (16 cm x 16 cm) e i pettini da 1,5 mm. Assemblare le unità di elettroforesi su gel.
   2. Per preparare un gel di poliacrilammide nativo al 10%, mescolare 14 ml di ddH₂O, 1,25 ml di acido tris-borico-EDTA (TBE), 8,3 ml di acrilammide al 30%, 1,25 ml di glicerolo al 50%, 187,5 μl di persolfato di ammonio (APS) al 10% appena preparato e 12,5 μl di tetrametiletilendiammina (TEMED).
   3. Per preparare un gel di poliacrilammide nativo al 20%, mescolare 5,5 mL di ddH₂O, 1,25 mL di 10x TBE, 1,25 mL di glicerolo al 50%, 16,7 mL di acrilammide al 30%, 187,5 μL di APS al 10% e 12,5 μL di TEMED.
   4. Versare immediatamente la soluzione di acrilammide nel gel e inserire il pettine. Lasciare polimerizzare la miscela per circa 30 minuti.
3. Corsa in gel
   1. Rimuovere il pettine e riempire i serbatoi con il tampone di corsa per elettroforesi (0,5x TBE).
   2. Sciacquare i pozzetti del campione con un tampone TBE 0,5x, quindi eseguire il gel a 100 V su ghiaccio per 30 minuti. Sostituire il tampone di corsa con un TBE 0,5x nuovo.
   3. Caricare campioni da 20-25 μl in ciascun pozzetto.
   4. Utilizzare un gel di acrilammide nativo al 10% per il test EMSA e un gel di acrilammide nativo al 20% per i test enzimatici. Eseguire l'elettroforesi a 100 V sul bagno di ghiaccio fino a quando il marcatore blu di bromofenolo non è migrato nel quarto inferiore del gel.
4. Smontare le piastre di gel e tagliare il gel rimuovendo i pozzetti di carico e le corsie inutilizzate. Metti il gel in un tampone TBE 0,5x.
5. Tagliare la carta da filtro e la membrana di nylon alla dimensione del gel. Pre-bagnare la carta da filtro pulita e la membrana di nylon.
6. Assembla la pila per il trasferimento.
   1. Posizionare la membrana pre-bagnata sulla carta da filtro pre-bagnata.
   2. Posizionare il gel sulla membrana.
   3. Copri il gel con un altro strato di carta da filtro pre-bagnata.
   4. Rimuovere tutte le bolle d'aria facendo rotolare una pipetta pulita dal centro verso il bordo.
7. Trasferire i campioni dal gel alla membrana in un apparecchio elettroforetico semi-secco a 90 mA per 20 minuti.
8. Interrompere il trasferimento, quindi asciugare la membrana su una nuova carta da filtro per 1 minuto.
9. Reticolare i campioni irradiando la membrana a 120 mJ/cm² per 45-60 s in un reticolante a luce UV dotato di lampadine da 254 nm (funzione di reticolazione automatica). Asciugare la membrana all'aria a RT per 30 minuti.
10. Rilevamento della chemiluminescenza
    1. Protocollo 1: Utilizzare un volume standard di kit di rilevamento dell'acido nucleico chemiluminescente commerciale.
       1. Aggiungere 20 mL di tampone bloccante alla membrana e incubare per 15-30 minuti agitando delicatamente su un rotatore a 20-25 giri/min.
       2. Preparare la soluzione di tampone coniugato/bloccante aggiungendo 66,7 μL di streptavidina-perossidasi di rafano coniugato a 20 mL di tampone bloccante.
       3. Rimuovere delicatamente il tampone di blocco e sostituirlo con un tampone coniugato/bloccante. Incubare per 15 minuti su un rotatore a 20-25 giri/min.
       4. Lavare la membrana 4 volte con agitazione a 40-45 giri/min per 5 minuti ciascuna.
       5. Aggiungere 30 mL di tampone di equilibrio del substrato alla membrana. Incubare la membrana per 5 minuti agitando a 20-25 giri/min.
       6. Preparare la soluzione di lavoro del substrato aggiungendo 6 mL di soluzione di luminolo/enhancer a 6 mL di soluzione di perossido stabile. Evitare la luce.
       7. Coprire l'intera superficie della membrana con la soluzione di lavoro del substrato e incubare per 5 minuti.
       8. Scansiona la membrana in un sistema di imaging chemiluminescente per 1-3 s.

Tabella 1: I primer utilizzati per la PCR amplificano i frammenti genici di Meiob e Mov10.Le lettere in grassetto nei primer in avanti e indietro sono i siti di taglio BamHI e NotI; le lettere in grassetto corsivo in un primer inverso sono siti di taglio XhoI; le lettere in grassetto nelle caselle indicano i nucleotidi corrispondenti alla mutazione puntiforme R235A.

Frammenti	Primer	Sequenze (da 5' a 3')
MEIOB-A	inoltrare	CGGGATCCATGTTACTTTTTTTGATACACTTGCC
	inverso	PRESSOGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG
MEIOB-C	inoltrare	CCGCGTGGATCCATGGAACCAAAATACTTTACAACTTCA
	inverso	CGATGCGGCCGCCTCTTTATTTTCTCTTATATAATTCAGTAG
MEIOB-E	inoltrare	CCGCGTGGATCCATGTTACTTTTTTTGATACACTTGCC
	inverso	CGATGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG
MEIOB-E-mut	inoltrare	CTCTGATGTGGCAATAAATTTTAAC
	inverso	GTTAAAATTTATTGCCACATCAGAG
MOV10	inoltrare	GACGACGATGACAAGGGATCCATGCCTAGCAAGTTCAGCTGCC
	inverso	GCTTACTCAGCTAAGCTCGAGTCAGAGCTCATTTCTCCACTCTG

Tabella 2: Sequenze di substrati di DNA/RNA utilizzati in questo lavoro.

Per le figure	Nomi	Sequenze (da 5' a 3')
Figura 2, 5	36 nt ssDNA	5'-Biotina-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT
Figura 3	36 nt ssRNA	5'-Biotina-GUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGU
Figura 4	54 nt dsRNA a 5' coda	5'-Biotina-ACCGCUGCCGUCGCUCCG-3' (RNA) 5'-ACGAGGGAGACGAGGAGACGGCGACGGCAGCGGU-3'(RNA)

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
attrezzatura
centrifuga	Eppendorf, Germania	5242R
Sistema di imaging chemiluminescente	Tanon, Cina	5200
Sonifero digitale	Branson, Stati Uniti	BBV12081048A	450 Watt; 50/60 HZ
Tampone elettroforetico semisecco	Hoefer, Stati Uniti	TE77XP
Revolver a tubo	Crystal, Stati Uniti	3406051
Reticolante a luce UV	UVP, Stati Uniti	CL-1000
materiali
Membrana in nylon	Thermo Scientific, Stati Uniti	TG263940A
Piatto di coltura trattato TC	Corning, Stati Uniti	430167	100 millimetri
Piatto di coltura trattato TC	Corning, Stati Uniti	430597	150 millimetri
Provette per microprovette	AXYGEN, Stati Uniti	MCT-150-C	1,5 ml
Tubi	Corning, Stati Uniti	430791	15 ml
Reagenti
Perline magnetiche M2 anti-FLAG	Sigma, Stati Uniti	Codice: M8823
ATP	Thermo Scientific, Stati Uniti	591136
Kit di sviluppo del colore della fosfatasi alcalina BCIP/NBT	Beyotime, Cina	Visualizzazione del materiale C3206
CelLyticTM Reagente per lisi cellulare M	Sigma, Stati Uniti	Codice 107M4071V
Kit di clonazione in un solo passaggio ClonExpress II	Vazyme, Cina	Visualizzazione del materiale C112
Kit di rilevamento dell'acido nucleico chemiluminescente	Thermo Scientific, Stati Uniti	T1269950
dNTP	Sigma-Aldrich, Stati Uniti	DNTP100-1KT
DMEM	Gibco, Stati Uniti	10569044
Edta	Invitrogen, Stati Uniti	AM9260G	0,5 milioni
Cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA	Roche, Stati Uniti	4693132001
Kit Maxi Plasmidi EndoFree	Vazyme, Cina	DC202
Mini kit per l'estrazione del DNA in gel FastPure	Vazyme, Cina	DC301-01
FBS	Gibco, Stati Uniti	10437028
Peptide FLAG	Sigma, Stati Uniti	F4799
glicerolo	Sigma, Stati Uniti	SHBK3676
Tampone HEPES	Sigma, Stati Uniti	SLBZ2837	1 M
KOAc	Sangon Biotech, Cina	127-08-02
MgCl2	Invitrogen, Stati Uniti	AM9530G	1 M
NaCl	Invitrogen, Stati Uniti	AM9759	5 milioni
NP-40	Amresco, Stati Uniti	M158-500ML
Opti-MEM medio	Gibco, Stati Uniti	31985062
Pbs	Gibco, Stati Uniti	10010023	pH 7,4
Inibitore della RNasi	Promega, Stati Uniti	N251B
Streptavidina fosfatasi alcalina	Promega, Stati Uniti	V5591
TBE	Invitrogen, Stati Uniti	15581044
Tampone Tris-HCI	Invitrogen, Stati Uniti	15567027	1 M, pH 7,4
Tampone Tris-HCI	Invitrogen, Stati Uniti	15568025	1 M, pH 8,0
Interpolazione-20	Sangon Biotech, Cina	A600560