Visualizzazione basata sull'immunofluorescenza delle interazioni proteiche di riparazione del DNA

Abstract

Fonte: de la Peña Avalos, B., et al., Visualizzazione dell'interazione delle proteine di riparazione del DNA mediante immunofluorescenza. J. Vis. Exp. (2020).

In questo video, descriviamo il metodo di immunofluorescenza per visualizzare la localizzazione delle proteine di riparazione del DNA γH2AX e 53BP1 nei siti di rotture del DNA a doppio filamento nei nuclei cellulari irradiati.

Protocollo

1. Estrazione nucleare e fissazione cellulare

1. Preparare le soluzioni madre: 0,2 M TUBI (pH 6,8), 5 M NaCl, 2 M saccarosio, 1 M MgCl₂, 0,1 M EGTA (pH 8,0).
2. Preparare il tampone di estrazione nucleare (NEB): sciogliere 10 mM di TUBI (pH 6,8), 100 mM di NaCl, 300 mM di saccarosio, 3 mM di MgCl₂, 1 mM di EGTA (pH 8,0) e 0,5% (v/v) di Triton X-100 in ddH₂O. Mescolare fino a completa dissoluzione.
3. Preparare paraformaldeide (PFA) al 4% (v/v): sciogliere 10 mL di soluzione acquosa di PFA al 16% in 30 mL di PBS. Mescolare fino a quando non si sarà completamente sciolto.
4. Al momento opportuno (t=0, 1, 2, 4, 16 h), lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS. Rimuovi completamente PBS.
5. Aggiungere 200 μL di NEB in ciascun pozzetto per l'estrazione dei nuclei cellulari (il citoplasma è degradato, rimane solo il nucleo) (Figura 1). Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente e rimuovere completamente.
   nota: Non superare i 2 minuti.
6. Lavare le celle con 1 mL di PBS. Rimuovi completamente PBS. Aggiungi PBS con attenzione, le cellule sono molto fragili in questa fase.
7. Aggiungere 200 μl di PFA al 4% (v/v) a ciascun pozzetto per la fissazione cellulare. Incubare per 10 minuti a 4 °C. Rimuovere completamente il PFA.
8. Aggiungere 1 mL di PBS.
   nota: Le celle possono essere conservate in PBS a 4 °C.

2. Colorazione in immunofluorescenza

1. Preparare la soluzione bloccante: sciogliere il 5% di BSA (p/v) in PBS e aggiungere lo 0,3% (v/v) di Triton X-100. Mescolare fino a completo scioglimento.
2. Preparare il tampone di diluizione: sciogliere l'1% di BSA (p/v) in PBS e aggiungere lo 0,3% (v/v) di Triton X-100. Mescolare fino a completo scioglimento.
3. Per il blocco, aggiungere 200 μL di soluzione bloccante a ciascun pozzetto. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente o 16-18 ore a 4 °C.
   nota: Se verrà utilizzato un anticorpo di capra, aggiungere il 5% di siero di capra alla soluzione bloccante.
4. Diluire l'anticorpo primario in tampone di diluizione (1:500; vedere la Tabella 1 per l'elenco degli anticorpi) e vorticare fino a quando non è ben miscelato.
   nota: Se si utilizza un anticorpo di capra, aggiungere l'1% di siero di capra al tampone di diluizione.
5. In una scatola di umidità/incubazione, far aderire un pezzo di parafilm. Aggiungere 10 μl di anticorpo primario (in una singola goccia). Allineare un bordo del vetrino coprioggetti con la goccia e abbassarlo lentamente sul parafilm, in modo che il liquido si diffonda (evitare bolle se possibile). Incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
6. Lavare i vetrini coprioggetti tre volte in PBS per 1 minuto.
7. Diluire l'anticorpo secondario nel tampone di diluizione (concentrazione finale: 2 μg/mL) e vortex fino a quando non è ben miscelato.
8. Applicare 10 μl di anticorpi secondari come descritto per gli anticorpi primari. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
   nota: Proteggere dalla luce.

Tabella 1: Anticorpi utilizzati. Elenco degli anticorpi utilizzati in questo studio.

anticorpo	società	riferimento	fonte
53BP1	Segnalazione cellulare	4937	coniglio
Anti-topo IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150103	asino
Anti-fosfo-istone H2A. X (Ser139), clone JBW301	Millipore	05-636	topo
IgG H&L anti-coniglio (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150081	capra

9. Lavare i vetrini coprioggetti tre volte in PBS per 1 minuto.
10. Lavare i vetrini coprioggetti con H₂O per 1 minuto.
11. Controcolorare il DNA con DAPI: applicare 10 μL di DAPI da 300 nM (come descritto per gli anticorpi), incubare per 30 minuti a temperatura ambiente e quindi montare su vetrino con un mezzo di montaggio a base di glicerolo. In alternativa, aggiungere una goccia (10 μl) di terreno di montaggio antisbiadimento commerciale contenente DAPI su un vetrino e applicare un vetrino coprioggetti. Premere delicatamente il vetrino coprioggetti e rimuovere il liquido in eccesso attorno ad esso con un tovagliolo di carta.
12. Sigillare i vetrini coprioggetti con smalto trasparente e lasciarli asciugare per 20 minuti.
13. Conservare i vetrini a 4 °C.

3. Acquisizione di immagini

1. Posizionare una goccia di olio da immersione sulla lente dell'obiettivo 60x. Utilizzare DAPI per localizzare i nuclei attraverso l'oculare.
   1. Per l'acquisizione di immagini XYZ, aprire il software di acquisizione e selezionare i parametri: Tipo di scanner: Galvano; Modalità scanner: andata e ritorno; Dimensione dell'immagine: 512×512; Modalità PMT: VBF; Media PMT: fotogramma (4 volte); Scansione sequenziale PMT: linea.
   2. Seleziona il colorante e i rilevatori:
      Canale (CH1), Colorante (DAPI), Rivelatore (SD1)
      Canale (CH2), Colorante (Alexa Fluor 488), Rivelatore (HSD3)
      Canale (CH3), Colorante (Alexa Fluor 647), Rivelatore (HSD4)
   3. Selezionare ON in "Z".
2. Regolare l'immagine dal vivo. Premere il pulsante Live nella finestra Live.
   1. Regolare la messa a fuoco e impostare l'intensità del laser (%), la sensibilità (HV), il guadagno e l'offset sulla finestra degli strumenti "PMT".
      1. Regolare l'intensità del laser (%): per la luminosità e la decolorazione. Maggiore è l'intensità del laser, più forte è il segnale, ma il campione fotosbianca.
      2. Regolare la sensibilità (HV): livello di rumore. Più alto è l'HV, più forte è il segnale, ma l'immagine sarà disturbata se troppo alta.
         NOTA: Mantenere sempre costante la tensione.
      3. Regola l'offset: livello di sfondo.
   2. Selezionare Inizio/Fine (15 sezioni) per le pile Z.
3. Inizia l'acquisizione.
   1. Seleziona la cartella in cui salvare le immagini. Premere il pulsante LSM Start per avviare l'acquisizione dell'immagine. Premere il pulsante Series Done per completare l'acquisizione dell'immagine.

Risultati

Figura 1. Estrazione nucleare.

Immagini rappresentative delle cellule prima (a sinistra) e dopo (a destra) l'estrazione nucleare. Il citoplasma deve essere digerito ma la struttura nucleare deve rimanere intatta dopo l'estrazione (a destra). (A) ingrandimento 20x; barra della scala = 20 μm e (B) ingrandimento 40x; barra di scala = 10 μm.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Coverglass #1, 18 mm rotondo (vetrini coprioggetti)	Neuvitro	NC0308920	I vetrini coprioggetti devono essere puliti e sterilizzati prima dell'uso, con HCl o etanolo.
DPBS, senza calcio, senza magnesio	Gibco	14190144	PBS per coltura tissutale
Montante SlowFade Diamond Antifade con DAPI	Invitrogen	S36973	alternativa è possibile utilizzare 300 nM DAPI con supporto di montaggio antisbiadimento VECTASHIELD.
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Si consiglia una frazione di shock termico, per evitare precipitazioni/fondo.
Triton X-100	Biografia americana	AB02025	Tampone per estrazione nucleare.
Vetrini per microscopio Superfrost Plus	Fisherbrand	1255015	In alternativa è possibile utilizzare i vetrini in polisina.