Saggio pull-down RNA-proteina per isolare le proteine leganti l'RNA tramite estrazione per affinità

Abstract

Fonte: Kresoja-Rakic, J., et al. Purificazione mediata da destiobiotina-streptavidina-affinità di proteine che interagiscono con l'RNA nelle cellule di mesotelioma. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra un test di pull-down dell'RNA in vitro per identificare le proteine leganti l'RNA (RBP), che interagiscono con le sequenze di elementi ricchi di adenilato-uridilato (ARE) nell'mRNA. Le RBP bersaglio di un lisato cellulare vengono mescolate con una sonda di RNA per formare complessi RNA-proteina. I complessi vengono isolati mediante purificazione per affinità utilizzando l'affinità dell'etichetta della destiobiotina della sonda a RNA per una microsfera magnetica marcata con streptavidina.

Protocollo

1. Preparazione della frazione proteica citosolica e nucleare

1. Piastra 4 x 10⁶ cellule ACC-MESO-4 in un pallone di coltura cellulare T150 coltivato in terreno RPMI - 1640 integrato con il 10% di FBS, 1x penicillina/streptomicina (100x) e 2 mM di L-glutammina (200 mM). Quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80-90% (~5-5,5 x 10⁶ cellule), procedere con l'estrazione proteica delle frazioni nucleari e citosoliche.
   nota: La linea cellulare ACC-MESO-4 è stata ottenuta dal RIKEN BioResource Centre.
2. Aspirare il terreno, lavare le cellule aggiungendo 15 ml di 1x PBS, inclinare delicatamente la piastra alcune volte e aspirare 1x PBS. Aggiungere 3 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% e incubare il pallone di coltura a 37 °C per 3 min.
   nota: Guarda le cellule al microscopio per il distacco; Se è ancora attaccato, picchiettare la fiaschetta contro il palmo di una mano 3 volte.
3. Aggiungere 7 mL di terreno RPMI-1640 integrato con il 10% di FBS, 1x penicillina/streptomicina (100x) e 2 mM di L-Glutammina (200 mM), raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 5 minuti.
4. Aspirare il terreno e risospendere il pellet cellulare con 1,5 mL di 1x PBS, quindi trasferire le cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifugare a 500 x g e 4 °C per 5 min. Scartare il surnatante.
   nota: Da questo passaggio in poi, eseguire tutte le fasi di centrifugazione a 4 °C e mantenere tutti i reagenti in ghiaccio.
5. Risospendere il pellet di cellule con 1,5 mL ghiacciati di 1x PBS e far girare le cellule a 500 x g e 4 °C per 3 minuti. Scartare il surnatante.
   nota: Le quantità richieste di reagenti CER I, CER II e NER sono rispettivamente 10, 0,55 e 5 volumi di volume stimato di pellet di cellule; il seguente protocollo presuppone un volume di 20 μL. Si consiglia di preparare solo la quantità richiesta di reagente CER I.
6. Aggiungere 200 μL di reagente per l'estrazione citoplasmatica a freddo ghiacciato (CER I) integrato con 2 μL di inibitore della proteinasi 1x, ad esempio diluire 1 compressa di Inibitore della proteasi (senza EDTA) in 500 μL di acqua per ottenere 100x stock. Questa quantità di reagente CER I è sufficiente per lisare 20 μl di un volume di pellet cellulare.
   1. Per stimare il volume impacchettato del pellet cellulare, confrontare la provetta contenente il pellet cellulare con una provetta da 1,5 mL riempita con 10, 20, 50 o 100 μL di 1x PBS.
7. Risospendere il pellet cellulare facendo vorticare energicamente la provetta per 15 s e incubare la provetta su ghiaccio per 10 minuti. Aggiungere 11 μl di reagente di estrazione citoplasmatica ghiacciato II (CER II) alla provetta, agitare vigorosamente per 5 s e incubare per 1 minuto su ghiaccio.
8. Agitare energicamente per 5 s e centrifugare la provetta a 16.000 x g e 4 °C per 5 min. Trasferire il surnatante nella provetta pre-raffreddata pulita con ghiaccio. Il surnatante è la frazione citoplasmatica che viene ulteriormente utilizzata nell'esperimento di pulldown dell'RNA.
9. Risospendere il pellet rimanente in 100 μL di reagente di estrazione nucleare (NER) ghiacciato integrato con 1 μL di inibitore della proteinasi (100x) e agitare vigorosamente per 15 s. Si consiglia di preparare solo la quantità necessaria di reagente NER integrato con inibitori della proteasi.
10. Incubare il campione su ghiaccio per 40 minuti con vortice occasionale per 15 s (ogni 10 minuti).
11. Centrifugare la provetta a 16.000 x g per 10 minuti. Trasferire il surnatante (questa è la frazione proteica nucleare) in una provetta pre-raffreddata pulita.
12. Procedere immediatamente misurando la concentrazione di proteine utilizzando il metodo bicinchoninic (BCA) (vedi Tabella dei materiali). Per controllare la purezza proteica di ciascuna frazione, eseguire l'immunoblotting (Figura 1) contro la α-tubulina (rilevamento positivo solo nella frazione citosolica) e la poli-ADP-ribosio polimerasi - PARP (rilevamento positivo solo nella frazione nucleare).
13. Al fine di mantenere l'attività delle proteine e il loro stato nativo, preparare 25 μL di aliquote di estratti citosolici e nucleari. Congelare queste aliquote mettendole in azoto liquido per 5 s e conservarle direttamente a -80 °C.

2. Marcatura dell'RNA con la destiobiotina

1. Sintetizzare commercialmente le sonde di RNA e purificarle con HPLC. Risospendere con acqua priva di nucleasi a 10 μM.
   nota: Le sequenze della sonda sono elencate nella Tabella 1.
2. Utilizzare 50 pmol di RNA per reazione di pulldown dell'RNA. Scongelare e mantenere tutti i reagenti in ghiaccio ad eccezione del PEG 30%, utilizzato per marcare il 3' terminale dell'RNA oligo.
3. Trasferire 5 μL di sonde di RNA da 10 μM, marcate come CALB2 3' UTR (ARE), CALB2 3' UTR (mtARE) e Unrelated-RNA (IRE), in provette per microcentrifuga a parete sottile da 0,5 mL e incubare in una macchina PCR a 85 °C per 5 minuti. Posizionare immediatamente le provette sul ghiaccio.
   nota: Questo passaggio è importante, in quanto favorisce il rilassamento e l'accessibilità della sonda RNA per la marcatura.
4. Per una singola reazione da 30 μL, aggiungere alla provetta contenente l'RNA la seguente miscela da 10 μL: 3 μL di acqua priva di nucleasi, 3 μL di tampone di reazione RNA ligasi 10x, 1 μL di inibitore della RNasi (40 U/μL), 1 μL di citidina bisfosfato destiobibiotinilato (1 mM) e 2 μL di RNA ligasi T4 (20 U/μL).
   nota: Per preparare una master mix A per 3 campioni in eccesso (3.2), mescolare 9,6 μL di acqua priva di nucleasi, 9,6 μL di 10x RNA Ligasi Buffer di reazione, 3,2 μL di RNasi inibitore (40 U/μL), 3,2 μL di destiobitinilato citidina bisfosfato (1 mM) e 6,4 μL di T4 RNA ligasi (20 U/μL).
5. Aggiungere con cautela 15 μL di PEG 30% alla reazione. Usa un'altra punta per mescolare la reazione. Incubare la reazione per una notte a 16 °C.
6. Il giorno successivo, preparare quanto segue: 5 M NaCl (fresco/privo di nucleasi), cloroformio: alcol isoamilico in rapporto 24:1 (ad esempio, per reazione - 96 μL di cloroformio e 4 μL di alcol isoamilico), etanolo ghiacciato al 100% ed etanolo ghiacciato al 70%.
7. Aggiungere 70 μl di acqua priva di nucleasi alle provette di reazione per la marcatura dell'RNA. Aggiungere 100 μl di cloroformio: alcol isoamilico e agitare brevemente. Centrifuga a 13.000 x g per 3 min. Rimuovere con cura SOLO la fase superiore e trasferirla in una nuova provetta da 1,5 mL priva di nucleasi; Evitare di toccare la fase inferiore.
8. Aggiungere 10 μl di NaCl 5 M, 1 μl di glicogeno e 300 μl di etanolo al 100% ghiacciato. Posizionare il tubo a -20 °C per 2 h.
   nota: A questo punto, l'esperimento può essere continuato il giorno successivo.
9. Centrifugare a 13.000 x g e 4 °C per 15 minuti. Scartare con cura il surnatante senza disturbare il pellet. Aggiungere 300 μl di etanolo ghiacciato al 70% e centrifugare nuovamente a 13.000 x g e 4 °C per 5 minuti.
10. Scartare completamente il surnatante e asciugare il pellet all'aria (15 min). Risospendere il pellet in 20 μL di acqua priva di nucleasi.
    nota: Procedere con il pulldown dell'RNA lo stesso giorno.
11. Incubare l'RNA a 90 °C per 2 minuti e metterlo sul ghiaccio. Posizionare l'RNA marcato sul ghiaccio durante la fase successiva del prelavaggio delle perle magnetiche di streptavidina.
    nota: Un tempo di incubazione più lungo può danneggiare la sonda a RNA.

3. Pulldown RNA-Proteina

1. Prelavaggio delle perle magnetiche di streptavidina e incubazione con destiobiotina-RNA
   1. Utilizzare 50 μL di perle magnetiche di streptavidina per 50 pmol di RNA. Tuttavia, questo dovrebbe essere ottimizzato a seconda dell'esperimento.
   2. Agitare la provetta con perle magnetiche per streptavidina per 15 s e rimuovere rapidamente 200 μl (master mix; sufficiente per 3+1 reazioni) in una provetta pulita da 1,5 mL con chiusura di sicurezza utilizzando puntali per pipette tagliati. Posizionare il tubo su un supporto magnetico in modo che le perline si raccolgano sul lato del tubo e attendere 1 minuto. Rimuovere il liquido di risospensione.
   3. Per lavare le perle, rimuovere la provetta dal supporto magnetico, aggiungere 400 μl di soluzione di NaOH 0,1 M e NaCl 0,05 M e pipettare delicatamente su e giù più volte. Riposizionare il tubo sul supporto magnetico. Attendere 1 minuto e raccogliere il surnatante. Ripetere nuovamente questo passaggio.
   4. Lavare le perle con 200 μl di NaCl 100 mM. Rimuovere il surnatante.
   5. Aggiungere 200 μl di Tris 20 mM (pH 7,5), risospendere le microsfere mediante pipettaggio, posizionare la provetta sul supporto magnetico, attendere 1 minuto e rimuovere il surnatante. Ripeti il passaggio.
   6. Rimuovere la provetta dal supporto magnetico, aggiungere 200 μl di tampone 1x RNA Capture e risospendere le perle magnetiche di streptavidina facendo un breve vortex. Rimuovere 50 μl di microsfere magnetiche di streptavidina e aggiungerle a ciascuna provetta di RNA marcata utilizzando un puntale di pipetta tagliato. Incubare le provette per 30 minuti a temperatura ambiente su un rullo.
2. Legame della proteina all'RNA
   1. Posizionare le provette in un supporto magnetico, attendere 1 minuto e rimuovere il surnatante.
   2. Aggiungere 50 μl di 20 mM di Tris (pH 7,5) alle microsfere e risospendere mediante pipettaggio. Posizionare le provette in un supporto magnetico, attendere 1 minuto e rimuovere il surnatante. Ripetere questo passaggio.
   3. Aggiungere 100 μl di tampone legante 1x proteina-RNA alle microsfere e risospendere mediante pipettaggio.
   4. Nel frattempo, preparare la seguente miscela: 10 μL di tampone legante proteina-RNA 10x, 30 μL di glicerolo al 50%, 50 μg di proteine citoplasmatiche e acqua priva di nucleasi fino a 100 μL.
      nota: Preparare una master mix B per 3 campioni in eccesso (3.3) come segue: 33 μl di tampone legante proteina-RNA 10x, 99 μl di glicerolo al 50%, 165 μg di proteine citoplasmatiche e acqua priva di nucleasi fino a 330 μl. Tenere la provetta della master mix B sul ghiaccio.
   5. Posizionare le provette nel supporto magnetico, attendere 1 minuto e raccogliere il surnatante. Aggiungere 100 μl di master mix B, risospendere pipettando delicatamente su e giù ed evitare la formazione di bolle. Incubare le provette di reazione per 60 minuti a 4 °C su un rullo.
3. Lavaggio ed eluizione
   1. Posizionare le provette in un supporto magnetico, raccogliere il surnatante (che è il flusso attraverso - FT) e trasferirlo in una nuova provetta.
      nota: Tenete questo FT in ghiaccio per un'analisi successiva.
   2. Pipettare 100 μl di 1x tampone di lavaggio sulle perline, risospendere delicatamente, rimettere nel supporto magnetico, attendere 1 minuto ed eliminare il surnatante. Ripeti questo passaggio 2 volte.
   3. Aggiungere 40 μl di tampone di eluizione alle microsfere magnetiche, miscelare pipettando su e giù e incubare a 37 °C su un agitatore per provette (950 giri/min) per 30 minuti.
   4. Posizionare le provette in un supporto magnetico, attendere 1 minuto e raccogliere il campione eluito (che è l'eluato - E). Mettere su ghiaccio e utilizzare per l'analisi a valle.
      nota: In questa fase, ogni sonda di RNA testata è costituita da un campione a flusso continuo (FT) e da un campione di eluato (E).

Risultati

Figura 1: Analisi Western blot di 5 μg di frazione proteica citosolica e nucleare. La proteina PARP è presente nella frazione nucleare (N) ma assente nella frazione citosolica (C). La α-tubulina è presente nella frazione citosolica (C) ma assente nella frazione nucleare (N).

Tabella 1: Sequenze di sonde di RNA

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
NE-PER Kit di estrazione nucleare e citoplasmatica	Thermo Fisher Scientifico	Codice: 78833
Compresse per inibitori della proteasi Pierce, senza EDTA	Thermo Fisher Scientifico	A32965
Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCA	Thermo Fisher Scientifico	Codice 23225
Kit di pull-down magnetico per RNA-proteina Pierce	Thermo Fisher Scientifico	Anno 20164	Include perline magnetiche e quindi il kit deve essere conservato a 4 °C
Kit di destiobitinilazione all'estremità dell'RNA Pierce 3'	Thermo Fisher Scientifico	20163	Il kit fa parte del "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit" e deve essere conservato a -20 °C a differenza del kit pull-down (4 °C).
DynaMag-2, supporto magnetico	Thermo Fisher Scientifico	Codice 12321D
RPMI - 1640 medio	Sigma-Aldrich	Codice: R8758
FBS - Siero Bovino Filtrato	Pan Biotech	P40-37500
Penicillina - streptomicina (100x)	Sigma-Aldrich	P4333
Soluzione di L-Glutammina (200 mM)	Sigma-Aldrich	G7513
0,25% tripsina-EDTA (1x)	Tecnologie Gibco by Life	Codice 25200-056
Soluzione di decontaminazione RNaseZap RNasi	Thermo Fisher Scientifico	AM9780
Oligosintesi di RNA	Mycrosynth AG, Svizzera	-	La scala di sintesi - 0,04 μmol - Purificato per HPLC
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	Codice: A7030
Acido cloridrico (HCl) 6 M	PanReac AppliChem	Codice 182883.1211
Tris ultra puro da 1 m, pH 7,5	Thermo Fisher Scientifico	15567027
glicerolo	Thermo Fisher Scientifico	Telefono 17904	Aliquote sterili al 50% da conservare a -20°C
Perle magnetiche Pierce Streptavidin	Thermo Fisher Scientifico	Codice 88817	Si prega di notare che queste biglie magnetiche hanno un diametro medio di 1 μm (intervallo da 0,5 a 1,5 μm). Inoltre, la streptavidina Dynabeads-M280, che sono perle di dimensioni omogenee di 2,8 μm, sono utilizzate anche nel pulldown dell'RNA, ma tieni presente che ciò può influenzare il processo di purificazione.
Solfato di alluminio-(14-18)-idrato	Sigma-Aldrich	368458
Acido orto-fosforico	Applichem	Codice A0637