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1. Reazione di legame con le proteine e separazione dell'RNA legato
- Effettuare il legame di proteine e RNA in 10 mM di Tris-HCl, pH 7,5 in un volume di 100 μL aggiungendo i seguenti ingredienti a queste concentrazioni finali: 50 mM di KCl, 1 mM di DTT, 0,09 μg/μL di albumina sierica bovina, 0,5 unità/μL di RNasina, 0,15 μg/μL di tRNA, 1 mM EDTA, e 30 μL di appropriata concentrazione di proteina ricombinante (PTB). Aggiungere RNA dal pool appropriato.
nota: Il fattore di splicing U2AF65 si lega tipicamente ai siti di splicing del tratto di polipirimidina/3' degli introni del modello con un'affinità di legame (costante di dissociazione dell'equilibrio o Kd) di circa 1-10 nM. Pertanto, i primi due cicli di legame hanno utilizzato una concentrazione proteica 10 volte superiore al Kd per U2AF65; per le proteine SXL e PTB, la concentrazione iniziale in questo intervallo era solo la nostra migliore ipotesi. Ciò ha assicurato che le specie di RNA desiderate potessero legarsi, sebbene anche le sequenze di affinità più basse fossero potenzialmente legate. Nei cicli 3 e 4 (trascrizione, legame e amplificazione), la concentrazione proteica è stata ridotta di tre volte. Questo è stato fatto per eliminare con successo le specie di RNA a bassa affinità.
- Porre le provette contenenti le reazioni di legame per circa 30 minuti a 25 °C in un blocco di temperatura (o sul ghiaccio).
- Frazionare l'RNA legato dall'RNA non legato per i primi 4 cicli di selezione-amplificazione utilizzando i seguenti passaggi.
- Filtrare il campione (100 μL) a temperatura ambiente attraverso un filtro alla nitrocellulosa collegato a un collettore a vuoto.
nota: Il complesso RNA-proteina, ma non l'RNA non legato, rimane sul filtro.
- Tagliare il filtro con l'RNA trattenuto in frammenti con una lama di rasoio sterile; inserirli in una provetta da centrifuga. Recuperare l'RNA facendo rotolare delicatamente la provetta per un minimo di 3 ore (o durante la notte) con i pezzi del filtro immersi nel tampone proteinasi K (PK).
- Deproteinizzare il campione di RNA facendolo vorticare in presenza di un uguale volume di fenolo-cloroformio (1:1) e quindi di cloroformio. Recuperare ogni volta la fase acquosa centrifugando il campione ad alta velocità per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Mescolarlo con acetato di sodio (0,1 volume di 3,0 M, pH 5,2) ed etanolo (2-3 volumi di etanolo assoluto, 200 proof). Lasciare la provetta in congelatore a -80 °C per 30 min, centrifugarla ad alta velocità per 10 min e, seguendo le fasi di lavaggio e asciugatura, solubilizzare l'RNA in acqua trattata con DEPC.
- Separare le frazioni di RNA legate alle proteine dalle frazioni non legate per gli ultimi 2 cicli (cicli 5 e 6; trascrizione, legame e amplificazione) come segue. Ridurre la concentrazione proteica nella reazione di legame (passaggio 1.1) di ulteriori tre volte per ottenere un'ulteriore pressione di selezione per arricchire le sequenze di legame ad alta affinità e rimuovere preferenzialmente le sequenze a bassa affinità.
- Pre-castare un gel di poliacrilammide nativo (5% con rapporto acrilammide:bis-acrilammide 60:1) in tampone TBE 0,5x (Tris-Borato-EDTA) prima di impostare la reazione di legame RNA:proteina (passaggio 1.1) di cui sopra. Elettroforare questo gel in una cella frigorifera (4 °C) applicando 250 V per 15 min.
- Pipettare le reazioni di legame RNA:proteina di cui sopra (passaggio 1.1) in diversi pozzetti di questo gel.
nota: La proteina viene conservata a -80 °C e diluita prima dell'uso in 20 mM di acido 4-(2-idrossietil)piperazina-1-etansolfonico (HEPES), pH 8,0, glicerolo 20%, acido etilendiamminotetraacetico 0,2 mM (EDTA), 0,05% NP-40 e 1 mM di ditiotreitolo (DTT). L'aggiunta di 0,5-1,0 mM di inibitore della proteasi fenilmetano sulfonilfluoruro (PMSF) è facoltativa. Nella reazione di legame, questo tampone contribuisce con circa il 6% di glicerolo, che consente il caricamento diretto dei campioni nei pozzetti senza la necessità di mescolarli con un tampone di caricamento del gel separato.
- Frazionare l'RNA legato dall'RNA non legato utilizzando l'elettroforesi su gel in una cella frigorifera (4 °C) a 250 V per 1 o 2 ore. Questo processo è noto anche come saggio di spostamento della mobilità del gel.
NOTA: La durata dell'elettroforesi varia a seconda delle caratteristiche dell'RNA e della proteina utilizzata per il legame.
- Esporre il gel a una pellicola a raggi X e identificare la posizione dell'RNA legato utilizzando l'autoradiografia. Ritagliare la fetta di gel con l'RNA legato e inserirla in una provetta.
- Incubare la fetta di gel frantumato nel tampone PK utilizzato per l'eluizione per 3 ore o durante la notte.
- Agitare vigorosamente il campione di RNA eluito prima con fenolo-cloroformio e poi con cloroformio.
- Miscelare l'acetato di sodio e l'etanolo con la fase acquosa dopo l'estrazione del cloroformio. Dopo l'incubazione in un congelatore a -80 °C, centrifugare a 4 °C per 5-10 minuti per raccogliere il pellet di RNA. Lavare il pellet di RNA con etanolo e asciugarlo all'aria lasciando aperto il coperchio della provetta. Sciogliere l'RNA in acqua trattata con DEPC.
nota: Il passaggio al saggio di spostamento della mobilità su gel per il frazionamento consente l'eliminazione di specie di RNA indesiderate che potrebbero essere state arricchite per il legame, ad esempio, al filtro di nitrocellulosa qui (o a qualsiasi matrice) utilizzato nei cicli iniziali per il frazionamento.
2. Trascrizione inversa e amplificazione PCR
- Sintetizzare il cDNA dall'RNA disciolto utilizzando la trascrittasi inversa e il primer inverso incubando la reazione da 20 μL (2 μL di tampone RT 10x, 2 μL di trascrittasi inversa AMV, 1 μM di primer inverso, 10 μL di RNA, inibitore della RNasi opzionale) a 42 °C per 60 minuti.
- Amplificare il cDNA utilizzando 20-25 cicli di PCR. Collegare il promotore della RNA polimerasi T7 alla libreria mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) contenente 1 μM di modello di libreria casuale di DNA, 1 μM di ciascun primer, 20 mM Tris (pH 8,0), 1,5 mM di MgCl2, 50 mM di KCl, 0,1 μg/μL di albumina sierica bovina acetilata, 2 unità di Taq polimerasi e 200 μM ciascuno di dNTP (deossiguanosina, deossiadenosina, deossicitidina e deossitimidina trifosfato).
3. Trascrizione e legame proteico
- Ripetere il processo di sintesi dell'RNA, legame proteico e separazione delle frazioni legate alle proteine e non legate.