1. Preparazione dei materiali
- Preparare soluzione salina tamponata con fosfato (PBS): 137 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM NaH2PO4 e 2 mM KH2PO4, pH 7,4.
- Preparare il colorante NTA-Atto 647 N. Diluire il colorante stock NTA-Atto 647 N a 100 nM da una soluzione di DMSO al 100% in PBS senza Tween.
- Express Vam7-His8 – Proteina come proteina di fusione in E. coli e purificarla utilizzando Ni-NTA e cromatografia ad esclusione dimensionale.
- Titolare l'analita in tampone PBS. Se l'analita si trova in un tampone diverso, l'MST marcato non è particolarmente sensibile alle differenze di tampone minori rispetto a molecole come il DMSO, a meno che il contenuto del tampone dell'analita non interagisca con la proteina marcata.
2. Preparazione del dispositivo MST
- Accendere l'interruttore di alimentazione sul retro del dispositivo.
- Aprire il software di controllo e assicurarsi che il laptop sia acceso e connesso sul computer collegato al dispositivo.
- Immettere le impostazioni di fluorescenza e MST per questo esperimento. Impostare MST Before su 3 s, MST su 30 s e Recupero fluorescenza (Fluo.)dopo 1 s. Prima misura la fluorescenza iniziale e non richiede tempi lunghi; MST è la quantità effettiva di tempo per il raggiungimento dell'equilibrio dopo l'induzione del calore.
- Tabella dei capillari: per ogni tubo capillare, inserire il nome del bersaglio (ligando), il nome del ligando (analita), la concentrazione del bersaglio e la concentrazione di titolazione più alta e utilizzare il rapporto di titolazione autofill. Ad esempio, immettere 50 nM per la concentrazione target di Vam7-His8, Vam7-His8 per il nome target, (acido 1,2-diottanoilfosfatidico) Di-C8 PA per il nome del ligando e la concentrazione più alta del ligando selezionando 1:1 e trascinando verso il basso per il riempimento automatico degli slot 2-16.
- Eseguire una scansione del tappo per selezionare il LED appropriato (20% LED (preimpostato)) in base al segnale della proteina bersaglio e regolare tra 200 e 2000 unità di fluorescenza per l'MST marcato. Le scansioni del tappo dovrebbero mostrare picchi uniformi arrotondati a forma di campana.
- Selezionare un intervallo di potenze MST e inserire i valori per ciascuna di esse per verificare l'accoppiamento più robusto e premere Start Cap Scan + Measurement, scansionando valori diversi per determinare le migliori condizioni operative per l'interazione in esame.
- Determina la potenza MST con l'adattamento migliore utilizzando il software di analisi e il preset per la termoforesi con Tjump. Analizza gli adattamenti in base alla separazione della fluorescenza più alta tra la concentrazione più bassa e quella più alta rispetto alla potenza MST con l'adattamento migliore e seleziona la potenza MST per le prove di replica.
- Determina se si è verificato un fotobleaching tra la prima e la seconda esecuzione accedendo al software di analisi e impostando l'analisi in modalità esperto. Quindi, selezionare la fluorescenza anziché la termoforesi per l'analisi. Seleziona la modalità esperto e poi il fotosbiancamento.
3. Preparazione dei campioni per l'MST marcato
- Portare la soluzione Vam7-His8 a una concentrazione di 200 nM in PBS senza Tween.
- Porta il colorante NTA-Atto 647 a 100 nM in PBS senza interpolazione.
- Miscelare il colorante Vam7-His8 e NTA-Atto 647 ad un rapporto volumetrico 1:1 e lasciarlo riposare a temperatura ambiente coperto dalla luce per 30 minuti. Determinare la concentrazione appropriata della proteina bersaglio come nel paragrafo 2.5 (vedere il supplemento sull'utilizzo della KD del colorante Ni-NTA come dimostrato nel video).
- Centrifugare la miscela di colorante NTA-Atto 647 N e proteine per 10 minuti in una camera buia utilizzando una centrifuga da tavolo a circa 8.161 x g.
- Conservare la miscela a 4 °C dopo l'esperimento o in ghiaccio durante l'esperimento per riutilizzarla entro poche ore, se necessario, per evitare che le proteine si denaturino.
- Utilizzare il cercatore di concentrazione NT per determinare l'intervallo di concentrazione necessario per la titolazione.
- Portare Di-C8 PA alla concentrazione massima appropriata in acqua.
- Titolare l'analita utilizzando una diluizione seriale 1:1 in tampone PBS per 16 concentrazioni in base al passaggio precedente. A differenza dell'SPR, la termoforesi non è così sensibile alle differenze del tampone.
4. MST dei campioni
- Accendi il dispositivo e il laptop collegato.
- Premere la freccia su sulla parte anteriore della macchina e far scorrere il rack capillare verso l'esterno.
- Caricare i capillari nel rack con la concentrazione più alta in posizione 1.
- Nel software di controllo, selezionare il canale rosso corrispondente a NTA-Atto 647 N.
- Inserire le informazioni sulla concentrazione, la posizione e il nome per ciascun capillare nella Tabella dei capillari.
- Esegui una scansione capillare premendo Start Cap Scan al 20% del LED (preimpostato) e regola di conseguenza tra 200 e 2000 unità di fluorescenza utilizzando le impostazioni di intensità del LED o la concentrazione del ligando (proteina marcata).
- Selezionare un intervallo di alimentazione MST.
- Avvio della scansione del tappo + misurazione MST.
- Analizza utilizzando il software di analisi.