Citometria a flusso quantitativa per studiare le interazioni tra vescicole proteina e fosfolipidi marcate

Abstract

Fonte: Podoplelova, N. et al., Analisi dell'interazione delle proteine marcate con la fluorescenza con microvescicole fosfolipidi artificiali utilizzando la citometria a flusso quantitativa. J. Vis. Exp. (2022)

In questo video, dimostriamo l'interazione tra proteine e vescicole fosfolipidiche artificiali utilizzando la citometria a flusso quantitativa. Il legame delle proteine marcate con fluorescenza alle vescicole fosfolipidiche marcate con fluorescenza aumenta l'intensità media della fluorescenza, e questo aumento viene rilevato da un citometro a flusso.

Protocollo

1. Rilevamento dell'interazione proteina-lipide mediante citometria a flusso

1. Esperimenti di legame cinetico
   1. Diluire le vescicole fosfolipidiche nel tampone di Tyrode (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 0,4 mM NaH₂PO₄, 2,5 mM CaCl₂, 5 mM glucosio, 0,5% BSA, pH 7,4) a una concentrazione di 1 μM e un volume totale di 250 μL.
   2. Miscelare il fattore X della coagulazione marcato con fluorescenza (fX-fd) della fase 1 a una concentrazione di 500 nM con le vescicole fosfolipidiche della fase 1.1.1 in un rapporto 1:1 (concentrazione finale della vescicola 0,5 μM, la concentrazione fX-fd è 250 nM di fX) per un volume totale di 500 μL.
   3. Iniettare immediatamente i 500 μl della sospensione miscelata (~20 min per analisi con una bassa velocità di flusso) nel citometro a flusso. Utilizzare una portata bassa e assicurarsi che la soglia per il canale FL2 (eccitazione 488 nm, filtro emissioni 585/42 nm) sia pari a 200. Misurare la fluorescenza media nel canale FL4 (eccitazione 633 nm, filtro di emissione 660/20) per il colorante a fluorescenza dalla Tabella dei materiali.
      nota: Scegli un citometro senza autocampionatore. Ciò accelererà il processo di iniezione del campione nella cella di misura.
   4. Quando si raggiunge la saturazione del legame (nessun aumento significativo della fluorescenza entro 5 minuti), diluire rapidamente il campione di 20 volte con il tampone di Tyrode e monitorare la dissociazione fino al raggiungimento della fluorescenza basale (dissociazione completa) o fino al raggiungimento di un plateau (nessuna diminuzione significativa della fluorescenza entro 5 minuti).
      nota: Come controllo, aggiungere 10 μM di EDTA e monitorare la dissociazione completa per 5 minuti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Alexa Fluor 647 NHS Estere (Succinimidil Estere)	Thermo Fisher Scientifico	E 37573	Colorante fluorescente
BD FACSCantoII	BD Bioscienze
DiIC16(3) (1,1'-Dioesadecil-3,3,3',3'-Tetrametilindocarbocianina Perclorato)	Thermo Fisher Scientifico	D384	Colorante fluorescente
Dmso	Sigma Aldrich	D8418
HEPES	Sigma Aldrich	H4034-500G
L-α-fosfatidilserina (cervello, suino) (sale sodico)	Avanti Polar Lipids	Codice 840032P
L-α-fosfatidilcolina (cervello, suino)	Avanti Polar Lipids	840053P
Mini-estrusore	Avanti Polar Lipids	Codice 610020-1EA
cloruro di potassio	Sigma Aldrich	P9541-500G
Cloruro di calcio, anidro, polvere, ≥97%	Sigma Aldrich	C4901-100G
Sodio fosfato monobasico	Sigma Aldrich	S3139-250G
cloruro di sodio	Sigma Aldrich	S3014-500G
cloruro di magnesio	Sigma Aldrich	Codice: M8266-100G
Albumina sierica bovina	VWR Life Science AMRESCO	AM-O332-0.1
Sale disodico EDTA	VWR Life Science AMRESCO	Am-O105B-0.1