NOTA: I tamponi devono essere filtrati utilizzando un filtro da 0,22 μm e degassati sotto vuoto per 1 ora.
1. Preparazione delle vescicole lipidiche
- Utilizzare provette di vetro da 2 ml. Sciogliere ciascun lipide, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1-palmitoil-2-oleoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (POPS) e colesterolo (Chol), in una miscela di cloroformio/metanolo (50:50 v/v) per preparare una soluzione lipidica limpida da 5 mM. Sciogliere l'1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-mio-inositolo-4',5'-bisfosfato) (PI(4,5)P2) in una miscela di cloroformio/metanolo/acqua (20:9:1 v/v).
- Combinare i lipidi disciolti nel rapporto molare desiderato di POPC/POPS (80/20), POPC/PI(4,5)P2 (95/5), POPC/POPS/Chol (60/20/20), POPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (60/17/3/20) e POPC/DOPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol (37/20/20/3/20) (Tabella 1) in provette di vetro da 10 mL.
nota: La quantità finale di lipidi totali è di 500 μg.
- Evaporare i solventi organici utilizzando un flusso secco di azoto. Lasciare la miscela lipidica in un sistema ad alto vuoto (liofilizzazione) per 3 ore per rimuovere eventuali tracce residue dei solventi.
nota: Ciò si traduce in un film secco e trasparente.
- Risospendere il film lipidico in 1 mL di tampone citrato (10 mM di trisodio-citrato, 150 mM di NaCl, pH 4,6). Incubare la sospensione lipidica a 60 °C (questa temperatura è di circa 10 °C al di sopra della temperatura di transizione di fase del lipide con il più alto punto di fusione nella miscela) per 30 minuti a bagnomaria e agitarla energicamente ogni 5 minuti
nota: Ciò si traduce nella formazione di grandi vescicole multilamellari (MLV). Mantenere la sospensione al di sopra della temperatura di transizione.
- Preriscaldare l'estrusore (in questo caso a 60 °C) dotato di una membrana in policarbonato di 50 nm di diametro al di sopra della temperatura di transizione (che qui è di 40 - 50 °C) per 30 minuti.
- Caricare la sospensione MLV nell'estrusore preriscaldato e far passare delicatamente la miscela 31x attraverso la membrana in policarbonato per formare piccole vescicole unilamellari (SUV). Mantenere la temperatura al di sopra della temperatura di transizione.
- Trasferire la sospensione SUV in un recipiente di reazione in plastica da 2 mL e aggiungere il tampone citrato (vedere passaggio 1.4) per portare il volume finale a 2 mL.
nota: Ciò produrrà una concentrazione lipidica finale di 250 μg/mL.
2. Manipolazione dei sensori al quarzo
NOTA: Maneggiare sempre i sensori al quarzo con una pinzetta.
- Incubare quattro sensori inseriti in un supporto di politetrafluoroetilene in una soluzione SDS al 2% per ≥ 30 minuti. Lavarli accuratamente con acqua ultrapura per rimuovere completamente la SDS e lasciarli asciugare utilizzando un getto di argon secco o azoto.
- Utilizzare un sistema di pulizia al plasma per rimuovere completamente eventuali contaminanti. Inserire i sensori a secco nella camera di pulizia al plasma, evacuare la camera e lavarla 3 volte con ossigeno. Accendi il pulitore al plasma. Utilizzare i seguenti parametri di processo: 1 x 10-4 Torr di pressione, alta potenza a radiofrequenza (RF) e 10 minuti di tempo di processo. Spegnere la macchina ed estrarre i sensori.
3. Funzionamento della microbilancia
NOTA: È stato utilizzato un sistema di microbilancia con quattro camere di flusso a temperatura controllata in configurazione parallela, collegate a una pompa peristaltica e impostate su una portata di 80 μL/min. Nella modalità a flusso aperto, il tampone è stato pompato dal serbatoio di alimentazione nel serbatoio di ricezione. Nella modalità loop, il serbatoio ricevente è stato collegato al serbatoio di alimentazione per generare un circuito chiuso. La temperatura è stata impostata a 20 °C.
- Agganciare con cautela i sensori puliti al plasma nelle 4 camere di flusso, utilizzando una pinzetta. Evitare qualsiasi pressione o torsione delle camere e dei tubi che potrebbe causare perdite.
- Lavare il sistema con tampone citrato (10 mM di trisodio-citrato, 150 mM di NaCl, pH 4,6) in modalità a flusso aperto per 10 min.
nota: Ciò richiede esattamente 3,2 ml di tampone, ma è consigliabile utilizzare un tampone in eccesso (10 ml).
- Avvia il programma. Iniziare a registrare eventuali cambiamenti nella frequenza e nella dissipazione del primo tono fondamentale (n = 1°) e degli armonici (n = 3° - 13°) utilizzando il software, fino a quando le linee di base di frequenza e dissipazione sono stabili (questo richiederà circa 40 - 60 minuti).
nota: I livelli di rumore in frequenza (picco-picco) devono essere inferiori a 0,5 Hz e, per la dissipazione, inferiori a 0,1,10-6, con una deriva massima (in soluzione acquosa) di 1 Hz/h in frequenza e 0,3,10-6/h in dissipazione.
- Quando i valori di base sono stabili, applicare la sospensione del SUV in tampone citrato (2 mL in un tubicino). Utilizzando un recipiente di reazione, rimuovere 1,5 mL del volume morto. Quindi chiudere il sistema in modalità loop-flow. Registrare lo spostamento di frequenza/dissipazione per altri 10 minuti.
nota: Durante questo periodo, le vescicole si diffonderanno sulla superficie del SiO2 e si fonderanno per formare un doppio strato continuo (passaggio 2 nelle Figure 1, Figura 2 e Figura 3). L'adsorbimento del SUV sulla superficie del sensore è bifasico e ha una frequenza minima e massima tipica nella dissipazione. Una nuova linea di base stabile di frequenza/dissipazione con uno spostamento di frequenza caratteristico (a seconda della composizione lipidica) da 26 a 29 Hz (vedi Tabella 1) indica un doppio strato continuo sulla superficie.
- Quando l'SLB è stabile (vedere il passaggio 3.4), equilibrare il sistema con il tampone in esecuzione (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) alle concentrazioni di Ca2+ richieste (comprese tra 50 μM e 1 mM di CaCl2, a seconda dell'esperimento) in modalità a flusso aperto per 40 minuti.
- Aggiungere la proteina (in questo caso, AnxA2) al tampone di corsa contenente Ca2+ (vedere il passaggio 3.5). Eseguire l'applicazione della proteina in modalità loop-flow fino al raggiungimento di uno stato stazionario di equilibrio (passaggio 3 in Figura 1, Figura 2 e Figura 3).
nota: La concentrazione proteica può variare da 1 a 400 nM. L'adsorbimento delle proteine determina uno spostamento di frequenza dipendente dalla concentrazione che riflette l'adsorbimento della massa (proteina).
- Dissociare la proteina legata chelando gli ioni Ca2+ con 5 mM di EGTA nel tampone in esecuzione in modalità a flusso aperto (passaggio 4 nelle Figure 1 e Figura 2).
nota: Un recupero della frequenza e della dissipazione al basale SLB indica la totale reversibilità del legame proteico. I cicli di associazione-dissociazione possono essere ripetuti per confrontare diverse concentrazioni o proteine.
