$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Imaging della formazione di condensa EWS-FLI1 su tende di DNA
- Aprire il software di imaging, trovare e contrassegnare le posizioni dei 3 × 3 modelli a zig-zag sotto il campo luminoso.
- Attivare il flusso a 0,2 ml/min per colorare il DNA con il colorante DNA a doppio filamento per 10 minuti.
- Diluire mCherry-EWS-FLI1 con il tampone di imaging alla concentrazione di 100 nM in 100 μL nella provetta.
- Caricare il campione di proteine attraverso la valvola con una siringa di vetro da 100 μL e modificare la velocità di flusso a 0,4 mL/min.
- Accendi il laser a 488 nm e pre-scansiona ogni regione per controllare lo stato di distribuzione del DNA; seleziona la regione in cui le molecole di DNA si distribuiscono uniformemente. Impostare la potenza del laser al 10% per il laser a 488 nm e al 20% per il laser a 561 nm. Utilizzare il misuratore di potenza per misurare la potenza reale del laser vicino al prisma: 4,5 mW per il laser a 488 nm e 16,0 mW per il laser a 561 nm.
- Acquisizione delle immagini
- Inizia ad acquisire immagini a intervalli di 2 s con laser a 488 nm e 561 nm contemporaneamente.
- Cambiare la valvola dalla modalità manuale a quella di iniezione per consentire al tampone di imaging di lavare il campione proteico nella cella di flusso dopo 60 s.
nota: Questo processo richiederà ~30 s e il campo visivo sarà coperto da segnali mCherry non appena le proteine EWS-FLI1 raggiungeranno la cella di flusso.
- Per rimuovere l'EWS-FLI1 libero, continuare a lavare la cella di flusso con il tampone di imaging per 5 minuti con solo il laser a 561 nm acceso. Interrompere il flusso e incubare a 37 °C per 10 minuti.
- Attivare il flusso a 0,4 mL/min per consentire l'estensione del DNA e acquisire immagini a intervalli di 2 s tra diversi frame per ottenere dati ad alto rendimento della formazione di condensa EWS-FLI1.
2. Analisi dell'intensità per mCherry-EWS-FLI1
- Importa i dati come sequenze di immagini nel software ImageJ, seleziona i puncta in 25× siti GGAA in un quadrato di 8×8 pixel e salva l'immagine in formato .tif.
- Calcola l'intensità come somma dell'intensità nel quadrato di 8×8 pixel, incluso l'intero puncta, e rimuovi lo sfondo sottraendo l'intensità dello sfondo in un'area della stessa dimensione vicino al quadrato di 8x8 pixel.