Saggio di modulazione del pH su doppi strati lipidici supportati per rilevare le interazioni proteina-fosfoinositide

Abstract

Fonte: Shengjuler, D., et al., PIP-on-a-chip: uno studio senza etichetta sulle interazioni proteina-fosfoinositide. J. Vis. Exp. (2017)

In questo video, dimostriamo le interazioni proteina-fosfoinositide in un modello microfluidico utilizzando il saggio di modulazione del pH, utilizzando un colorante fluorescente sensibile al pH etichettato con il lipide fosfatidiletanolammina di un doppio strato lipidico supportato, chiamato piattaforma microfluidica. Le modulazioni del pH dopo il legame delle proteine con i fosfolipidi causano l'estinzione della fluorescenza.

Protocollo

1. Formazione di doppi strati lipidici supportati (SLB)

1. Trasferire 100 μl di SUV contenenti PI(4,5)P2 in una provetta per microcentrifuga da 0,65 mL. Regolare il pH della soluzione a ~3,2 aggiungendo 6,4 μl di acido cloridrico 0,2 N.
   nota: Confermare il pH della soluzione con un pHmetro dotato di micro sonda pH (vedi tabella dei materiali).
2. Pipettare 10 μl della soluzione SUV a pH regolato in ciascun canale attraverso l'ingresso e applicare pressione attraverso la pipetta fino a quando la soluzione non raggiunge l'uscita. Staccare la punta dalla pipetta e lasciarla attaccata al dispositivo.
3. Ripetere il passaggio precedente per ciascun canale e quindi incubare il dispositivo per 10 minuti a RT.
   nota: L'iniezione di vescicole nei microcanali deve essere eseguita immediatamente dopo l'assemblaggio del dispositivo.
4. Tagliare set di tubi di ingresso e uscita lunghi rispettivamente 60 cm (tubo di ingresso) e 8 cm (tubo di uscita).
   nota: Tagliando il tubo in diagonale e creando uno spigolo vivo, facilita l'inserimento del tubo negli ingressi e nelle uscite. Il tubo di uscita deve avere una forma ad arco. La lunghezza del tubo di ingresso può variare in base alla configurazione del microscopio. Il diametro interno del tubo è di 0,05 cm.
5. Utilizzando una pinzetta, collegare il set di tubi di uscita al dispositivo, quindi fissare il dispositivo con nastro adesivo su un tavolino da microscopio.
6. Immergere un'estremità del set di tubi di ingresso in 25 mL di tampone di scorrimento contenuto in un tubo conico e fissarlo con nastro adesivo per assicurarsi che il tubo sia fissato.
7. Posizionare il tubo conico su una superficie più alta (~20 cm) rispetto al dispositivo per spingere la soluzione attraverso i microcanali tramite flusso di gravità; a tale scopo è possibile utilizzare un martinetto da laboratorio.
8. Per ogni provetta di ingresso, utilizzare una siringa per prelevare 1 mL di tampone scorrevole dall'estremità libera del tubo. Rimuovere la punta della pipetta dall'ingresso e inserire l'estremità libera del tubo di ingresso nel dispositivo.
   nota: Introdurre una goccia di tampone in movimento sull'ingresso per ridurre la probabilità che una bolla d'aria venga introdotta nel canale durante questa fase. Dopo aver collegato il tubo di ingresso al dispositivo, utilizzare un panno privo di lanugine per rimuovere il tampone in eccesso.
9. Ripetere il passaggio precedente per collegare tutti i pezzi del tubo di ingresso al dispositivo.
   nota: Il fluido del buffer di scorrimento attraverso i canali aiuta a rimuovere le vescicole in eccesso e a bilanciare il doppio strato alle condizioni sperimentali.
10. Aprire il software di controllo del microscopio (vedere la tabella dei materiali). Nel pannello di sinistra, fai clic sulla scheda "Microscopio" e scegli l'obiettivo "10X".
11. Fare clic sulle icone dell'immagine "Live" e quindi su "Alexa 568" sulla barra degli strumenti. Utilizzando le manopole di regolazione fine e di rotta, mettere a fuoco i microcanali.
12. Eseguire la scansione del dispositivo per verificare la qualità degli SLB e dei canali (Figura 1). Quindi, fai clic sull'icona dell'immagine "FL Shutter Closed" sulla barra degli strumenti.
13. Fare clic sulla scheda "Acquisizione" e in "Regolazioni di base" selezionare "Tempo di esposizione". Impostare il tempo di esposizione su "200 ms".
14. Nel pannello di sinistra, fai clic su "Acquisizione multidimensionale" e nel menu dei filtri seleziona il canale rosso (contrassegnato come "Alexa 568"). Quindi, fai clic sul menu "time lapse", imposta l'intervallo di tempo su 5 minuti, la durata su 30 minuti e fai clic su "Avvia".
    nota: In base alla durata (30 min) e alla velocità di flusso (~1,0 μL/min), vengono utilizzati 30 μL di tampone di funzionamento per equilibrare l'SLB all'interno di un canale, ovvero 240 μL di tampone di funzionamento vengono utilizzati per tutti gli 8 canali.
15. Seleziona lo strumento "Cerchio" nella scheda "Misura" e disegna un cerchio in qualsiasi canale. Fare clic con il pulsante destro del mouse mentre il cerchio è selezionato e scegliere "Proprietà". Nella scheda "Profilo", seleziona "tutto T" per visualizzare l'intensità della fluorescenza in funzione del tempo.
    1. Assicurati che questa curva raggiunga un plateau, che indica l'equilibrio, prima di procedere al passaggio successivo.
16. Abbassare la soluzione tampone a una distanza pari a quella del dispositivo per arrestare il flusso.
17. Salva il file time lapse.

2. Test dell'interazione del dominio PH PLC-δ1 con SLB contenenti PI(4,5)P2

1. Preparare le diluizioni del dominio PH utilizzando il buffer in esecuzione come diluente.
   nota: Poiché ci sono otto canali all'interno del dispositivo, utilizzarne almeno due per i controlli vuoti. Raccogli le estremità più lontane su ciascun lato e usa i canali rimanenti per le diluizioni delle proteine. Sono state testate le seguenti concentrazioni del dominio PH: 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 e 2,50 μM. Circa 200 μL di ciascuna diluizione sono stati sufficienti per raggiungere l'equilibrio entro 30 minuti.
2. Uno alla volta, staccare ciascun tubo di uscita e applicare 200 μl di ciascuna diluizione proteica nel canale di uscita utilizzando una pipetta. Non applicare alcuna pressione, lasciare che la gravità faccia il lavoro. Staccare il puntale dalla pipetta e lasciarlo attaccato al dispositivo microfluidico.
3. Ripetere il passaggio precedente per ogni canale e assicurarsi che durante questo processo non vengano introdotte bolle d'aria nei canali.
4. Abbassare il tubo di ingresso a terra sotto il dispositivo microfluidico per iniziare a far fluire la proteina attraverso i microcanali. Fissare con nastro adesivo l'estremità libera del tubo a un contenitore per rifiuti. Far scorrere le diluizioni proteiche per 30 min.
   nota: Questo invertirà il flusso e consentirà alla proteina di essere introdotta nei canali. Il tempo di equilibrio e il volume delle diluizioni proteiche necessarie dipenderanno dall'affinità dell'interazione.
5. Nel pannello di sinistra del software, nella scheda "Time Lapse", fare clic su "Avvia" per ricominciare l'imaging.
6. Al termine dell'esperimento, salvare il file time lapse.

Risultati

Figura 1: Valutazione dell'integrità di SLB e microcanali. (A) Un'immagine che illustra SLB e microcanali di alta qualità. (B) Fusione incompleta. (C) Microcanali fusi. (D) Particella di polvere intrappolata all'interno di un microcanale. (E) Bolle d'aria intrappolate all'interno di microcanali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1-palmitoil-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850457C	POPC
L-α-fosfatidilinositolo-4-fosfato	Avanti Polar Lipids	Codice 840045X	PI4P
L-α-fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato	Avanti Polar Lipids	Codice 840046X	PI(4,5)P2
1-palmitoil-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine	Avanti Polar Lipids	850757C	papa; Necessario per la sintesi di oSRB-POPE
Lissamina, rodamina B, sulfonilcloruro (isomeri misti)	ThermoFisher Scientifico	L-20	Necessario per la sintesi di oSRB-POPE
Sonda lipidica fluorescente sensibile al pH (oSRB-POPE)	Interno	N/A	Sintesi interna (Huang D. et al. 2013)
Microscopio a epifluorescenza Axiovert 200M	Microscopia Carl Zeiss	N/A	microscopio
Fotocamera AxioCam MRm	Microscopia Carl Zeiss	N/A	macchina fotografica
X-Cite 120	Tecnologie Excelitas	N/A	sorgente luminosa
Set di filtri Alexa 568	Microscopia Carl Zeiss	N/A	Ex/Em 576/603 nm
Software AxioVision LE64 v.4.9.1.0	Microscopia Carl Zeiss	N/A	Software di elaborazione delle immagini
Suggerimenti	VWR	Codice 10034-132	200 uL puntali per pipette; Punta sottile e liscia per l'applicazione della soluzione proteica nel canale microfluidico
Suggerimenti	VWR	Codice: 53509-070	10 uL puntali per pipette; Punta sottile e liscia per l'applicazione della soluzione di vescicola nel canale microfluidico
Misuratore di pH Orion Star A321	Termo Scientifico	STARA3210	Misuratore di pH
Micro sonda di pH Orion	Termo Scientifico	8220BNWP	micro sonda di pH
Acido N-(2-idrossietil)-piperazina-N'-(2-etansolfonico)	VWR	VWRB30487	HEPES, acido libero
cloruro di sodio	VWR	BDH8014-2,5 KGR	NaCl
tubatura	Allied Wire & Cable	TFT-200-24 N	Diametro interno: 0,020-0,026 pollici (0,051-0,066 cm); Spessore della parete: 0,010 pollici (0,025 cm); Tubo flessibile in politetrafluoroetilene a parete sottile; Colore naturale
Azoto gassoso - Industriale	Praxair	N/A	Fornitore locale
Ossigeno gassoso - Industriale	Praxair	N/A	Fornitore locale
azoto liquido	Praxair	N/A	Fornitore locale