1. Impostazione del reagente e della soluzione
- Per preparare il DMEM completo, aggiungere 5 ml di L-glutammina 200 mM, 5 ml di penicillina-streptomicina 100x e 50 ml di siero fetale bovino (FBS, concentrazione finale del 10% vol/vol) a 440 ml di DMEM.
nota: Questa soluzione può essere conservata a 4 °C per 1 mese.
- Preparare la soluzione di agarosio sciogliendo 150 mg di agarosio a bassa gelificazione in 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a 85 °C per ottenere una soluzione all'1,5% (p/v). Sterilizzare mediante filtrazione con un filtro da 0,22 μm. Preparare 1 mL di aliquote di soluzione di agarosio in 1,5 N
- Preparare il terreno del bioreattore.
- Sciogliere 13,4 g di polvere di DMEM in 1 L di H2O. ultrapuro
nota: A seconda dell'applicazione, il volume finale richiesto può variare (ad esempio, per 500 mL di terreno, sciogliere 6,7 g di polvere in 500 mL H2O).
- Aggiungere il 2% di FBS, 10 mM di NaHCO3, 1x penicillina-streptomicina (100x) e il 2% di D2O (ad esempio, per 500 mL di terreno, aggiungere 10 mL di FBS, 0,4 g di NaHCO3, 5 mL di penicillina-streptomicina 100x e 10 mL di D2O).
- Misurare il pH utilizzando un pHmetro e, se necessario, regolare a 7,4 aggiungendo HCl.
nota: In genere, il pH iniziale è molto vicino a 7,4.
- Filtrare il terreno del bioreattore con un filtro sterile azionato dal vuoto in un flacone di vetro sterile da 250 ml o 500 ml.
- Nella cappa a flusso laminare, sigillare il flacone con un copritubo sterile in acciaio con due ugelli per tubi flessibili e collegarli a un tubo in FEP (d.e. = 1/8", d.i. = 1,6 mm) che verrà collegato alla pompa e a un filtro per siringa in PTFE da 0,22 μm per l'aspirazione dell'aria.
2. Configurazione del bioreattore
- Assemblare l'unità di flusso utilizzando un secondo tubo NMR dell'unità di flusso, che verrà successivamente sostituito con quello contenente le celle. Fare riferimento alle istruzioni per l'uso dell'unità di flusso per il corretto montaggio.
nota: A questo punto, l'unità di flusso dovrebbe essere già pulita (in caso contrario, eseguire il passaggio 4.2).
- Impostare il bagnomaria collegato al regolatore della temperatura dell'unità di flusso a 37 °C. Posizionare il flacone del serbatoio nel bagnomaria.
- Collegare il tubo FEP della bottiglia del serbatoio alla pompa.
- Ruotare la valvola del bioreattore su "bypass" e preriempire la pompa con un fluido.
- Ruotare la valvola del bioreattore su "flusso" e preriempire il bioreattore con il fluido a 0,1 mL/min.
3. Preparazione del campione di cellule
- Raccogliere le cellule dall'incubatore di CO2.
- Prelevare un pallone T75 di cellule HEK293T trasfettate dall'incubatore di CO2 e rimuovere il terreno esaurito.
- Lavare le cellule due volte con 7 mL (ciascuna) di PBS a temperatura ambiente (~20 °C).
- Utilizzare 2 ml di tripsina/EDTA per staccare le cellule. Dopo aver aggiunto la soluzione, incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per staccare le cellule.
nota: Le cellule trasfettate possono impiegare un po' più di tempo per staccarsi. Se necessario, incubare le cellule a 37 °C.
- Inattivare la tripsina con 20 mL di DMEM completo; risospendere accuratamente le cellule pipettandole su e giù e trasferendole in una provetta da centrifuga da 50 mL.
- Centrifugare le cellule a 800 x g per 5 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
- Lavare le celle con 10 mL di PBS a temperatura ambiente per rimuovere il terreno residuo.
- Centrifugare le cellule a 800 x g per 5 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
- Trasferire il pellet cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL con tappo.
- Incorporare le cellule in fili di agarosio.
- Fondere un'aliquota di agarosio solidificato a 85 °C in bagnomaria e successivamente mantenerla in soluzione a 37 °C in un riscaldatore a blocchi.
- Con una pipetta Pasteur, riempire il fondo della provetta NMR dell'unità di flusso con 60-70 μl di gel di agarosio all'1,5% e immergerlo nel ghiaccio. In questo modo si crea un tappo inferiore alto ~5 mm che consente di posizionare il campione di cella all'interno del volume attivo della bobina NMR da 1H.
- Riscaldare il pellet di celle ottenuto al punto 3.1.8 a 37 °C per 15−20 s nel termoblocco.
- Risospendere le cellule in 450 μL di soluzione di agarosio. Fare attenzione ad evitare la formazione di bolle.
- Aspirare la sospensione di agarosio cellulare in un tubo in PEEK per cromatografia lungo ~30 cm (i.d. = 0,75 mm) collegato a una siringa da 1 mL.
nota: Prima dell'aspirazione, il tubo e il volume morto della siringa devono essere preriempiti con PBS a temperatura ambiente per evitare la formazione di bolle. La lunghezza del tubo non è critica.
- Lasciare raffreddare il tubo a temperatura ambiente per 2 minuti.
- Preriempire la provetta NMR dell'unità di flusso con 100 μL di PBS a temperatura ambiente.
- Fondere i fili delle cellule incorporate nell'agarosio nel tubo NMR dell'unità di flusso spingendo delicatamente la siringa.
nota: Per riempire la provetta NMR in modo omogeneo, iniziare posizionando l'estremità del tubo in PEEK nella parte inferiore della provetta NMR e procedere verso l'alto oscillando lentamente da sinistra a destra.
- Ripetere i passaggi 3.2.5, 3.2.6 e 3.2.8 fino a quando tutta la sospensione di agarosio cellulare è stata colata.
- Inserire le cellule nel bioreattore.
- Rimuovere il tubo NMR vuoto dall'unità di flusso e aumentare la portata a 2 ml/min per alcuni minuti per rimuovere le bolle di gas residue nel tubo di ingresso.
- Impostare la portata a 0,2 mL/min e inserire la provetta NMR contenente le cellule spingendola verso l'alto lentamente ma costantemente.
nota: Il flusso attivo del fluido evita il riflusso del contenuto del tubo attraverso l'ingresso che altrimenti si verificherebbe durante l'inserimento.
4. Funzionamento e pulizia del bioreattore
- Funzionamento del bioreattore durante l'esperimento NMR.
- Impostare la temperatura nello spettrometro NMR su 310 K.
- Inserire l'unità di flusso nello spettrometro.
- Fornire il terreno del bioreattore a una velocità di flusso di 0,1 mL/min per l'intera durata degli esperimenti NMR in cella.
- Al momento desiderato durante l'esperimento, iniettare una soluzione concentrata della molecola esterna nel flacone del serbatoio del terreno perforando il tubo di silicone con una siringa sterile ad ago lungo.
nota: La concentrazione finale della molecola nel mezzo deve essere scelta in base alle conoscenze pregresse sulla tossicità cellulare e, se disponibili, alla velocità di diffusione prevista/stimata attraverso la membrana cellulare.
- Al termine dell'esperimento NMR, sostituire il tubo contenente le celle con un tubo vuoto e sciacquare l'unità di flusso con acqua.
- Bioreattore clean-in-place.
- Pulire l'unità di flusso facendo scorrere le seguenti soluzioni a 1 mL/min: idrossido di sodio (NaOH) 0,2 M; acido citrico 3 M; NaOH 0,2 M, per almeno 30 minuti ciascuna, seguita da acqua ultrapura filtrata sterile per >2 ore.
- Pulire e sterilizzare in autoclave la bottiglia del serbatoio e il gruppo del tubo dopo ogni corsa.
5. Esperimenti NMR
- Configurazione degli esperimenti NMR.
nota: Eseguire questi passaggi in anticipo, prima della preparazione del campione NMR in cella, per evitare ritardi tra la raccolta delle cellule e l'acquisizione dei dati.
- Creare un nuovo set di dati sullo spettrometro NMR e impostare i parametri per gli esperimenti NMR desiderati.
- Imposta i parametri per gli esperimenti NMR 1D 1H.
- Centrare la frequenza portante di 1H a 4,7 ppm sul segnale dell'acqua.
- Selezionare il programma a impulsi zgesgp, impostare l'ampiezza spettrale a 20 ppm e un impulso quadrato a 1.000 μs a 180° per la soppressione dell'acqua. Impostare un ritardo tra le scansioni di 1 s. Acquisisci lo spettro con 32 scansioni.
- Per le celle che esprimono CA II non marcato: selezionare il programma di impulsi p3919gp, impostare l'ampiezza spettrale a 30 ppm per coprire la regione imminica dello spettro e regolare il ritardo per la soppressione binomiale dell'acqua in modo che l'eccitazione massima sia centrata agli spostamenti chimici dei segnali di interesse (d7 = 20 μs a 950 MHz). Impostare un ritardo tra le scansioni di ≥1 s. Acquisisci con 512 scansioni.
- Per le celle che esprimono 15SOD1 marcate con N: selezionare il programma di impulsi sfhmqf3gpph, impostare le larghezze spettrali 1H e 15N rispettivamente a 16 e 50 ppm, l'offset dell'impulso sagomato e la larghezza di banda di eccitazione rispettivamente a 8,5 e 6 ppm e un impulso di 350 μs per lo schema di disaccoppiamento (garp4 o altro a seconda dello strumento). Impostare un ritardo tra le scansioni di 0,3 s. Acquisisci 16 scansioni e 128 incrementi nella dimensione 15N.
- Acquisizione di spettri NMR in tempo reale.
- Una volta inserito il bioreattore nello spettrometro NMR, attendere qualche minuto per consentire il ricambio del mezzo.
nota: Questo processo è facilmente monitorato dall'aspetto del segnale di blocco poiché il PBS viene sostituito con un mezzo contenente il 2% di D2O.
- Regolare l'abbinamento e la sintonizzazione del canale 1H, spessorare il magnete e calcolare la lunghezza dell'impulso duro 1H 90°.
- Regolare i livelli di potenza di 1ora in ciascuna sequenza di impulsi in base all'impulso forte di 1ora.
- Registrare un primo spettro zgesgp 1H per verificare il contenuto del campione e l'omogeneità del campo.
- Copiare gli esperimenti zgesgp e p3919gp/sfhmqcf3gpph al numero desiderato e metterli in coda nello spooler di acquisizione.
ca: Gli spettri zgesgp vengono utilizzati solo per controllare lo stato del campione e l'omogeneità del campo; Pertanto, possono essere saltati o registrati meno frequentemente.
- Per le cellule che esprimono CA II non marcato: elaborare gli spettri p3919gp applicando la funzione di riempimento zero e la funzione della finestra di allargamento della linea esponenziale (LB = 20 Hz).
- Per le celle che esprimono 15SOD1 N-marcate: elaborare gli spettri sfhmqcf3gpph applicando il riempimento zero e la funzione della finestra sinusoidale quadrata (SSB = 2) in entrambe le dimensioni.
nota: La dimensione degli spettri elaborati può essere ulteriormente ridotta rimuovendo le regioni prive di segnali (in Topspin, questo viene fatto impostando i valori STSR e STSI desiderati).
