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NOTA: Di seguito sono riportati i passaggi per lo screening dei fagi T7 che riconoscono i farmaci utilizzando un biosensore QCM e per il recupero dei fagi sottoposti a screening tramite infezione da E. coli (BLT5615). I protocolli per la sintesi di un derivato di una piccola molecola che forma un monostrato autoassemblato (SAM) e per la costruzione della libreria di peptidi casuali a 15 mer visualizzati dal fago T7 possono essere trovati altrove.
1. Preparazione del chip del sensore QCM
- Collegare un chip sensore ceramico all'oscillatore di un apparecchio QCM a 27 MHz e registrare la frequenza intrinseca (Hz) nella fase aria prima dell'immobilizzazione di piccole molecole.
- Staccare il chip e far cadere 20 μL di una soluzione (1 mM in etanolo al 70%) di un derivato di una piccola molecola che forma SAM sull'elettrodo d'oro del chip del sensore utilizzando una pipetta.
cautela: Il cristallo del chip del sensore in cui si trova l'elettrodo d'oro (Au, 0,1 mm di spessore, 2,5 mm di diametro interno, 4,9 mm2) è estremamente sottile e può rompersi facilmente (SiO2, 0,06 mm di spessore, 9 mm di diametro interno). Quindi, pipettare con cura.
- Lasciare agire per 1 ora a temperatura ambiente (circa 20 °C) in una capsula di Petri con fazzoletto inumidito e al riparo dalla luce della stanza.
- Lavare delicatamente la superficie dell'elettrodo con acqua ultrapura, quindi rimuovere le gocce d'acqua soffiando aria con una siringa o uno spolverino ad aria.
- Impostare il chip del sensore per l'apparato QCM e registrare la riduzione della frequenza nella fase dell'aria per misurare la quantità della piccola molecola che è stata immobilizzata><.
nota: Almeno 100 Hz di frequenza intrinseca sono necessari per il successo dell'immobilizzazione di piccole molecole (1 Hz immobilizza 30 pg).
2. Biopanning della libreria di fagi T7 utilizzando un biosensore QCM (Figura 1)
- Posizionare una cuvetta con un agitatore magnetico dedicato sul biosensore QCM e versare 8 mL del tampone di reazione (10 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 7-8) nella cuvetta.
- Collegare il chip del sensore QCM all'oscillatore e tirare verso il basso il braccio dell'oscillatore per immergere il chip nel buffer da agitare a 1000 giri/min.
- Iniziare a monitorare la frequenza QCM sul personal computer (PC) e attendere che il sensorgram si equilibri a circa 3 Hz/min della deriva di frequenza.
- Iniettare 8 μL di una libreria di fagi T7 (1-2 × 1010 pfu/mL) nella cuvetta (concentrazione finale: 1-2 × 107 pfu/mL) e contrassegnare il punto di iniezione sul sensore.
- Monitorare la riduzione di frequenza causata dal legame dei fagi T7 alla piccola molecola immobilizzata sulla superficie dell'elettrodo d'oro per 10 minuti.
- Arrestare il monitor di frequenza QCM, rimuovere il chip del sensore dall'oscillatore e rimuovere il tampone soffiando aria e/o allontanando con salviette.
- Inserire il chip del sensore in una capsula di Petri umida e far cadere i 20 μl della sospensione di cellule ospiti di E. coli (BLT5615) (OD600 = 0,5-1,0 dopo l'agitazione a 37 °C aggiungendo IPTG a 1 mM) nella fase logaritmica sull'elettrodo d'oro.
- Chiudete il coperchio del piatto e copritelo con un foglio di alluminio per bloccare la luce.
- Incubare la piastra a 37 °C per 30 minuti su un miscelatore per micropiastre a 96 pozzetti (1000-1500 giri/min) per migliorare il recupero dei fagi T7 legati.
- Recuperare i 20 μL della soluzione e sospenderli in 200 μL di LB medium.
nota: I campioni ottenuti in questa fase possono essere conservati a 4 °C per una settimana.
- Preparare una serie di diluizioni della soluzione fagica per l'isolamento della placca e il sequenziamento del DNA secondo la procedura generale descritta nelle istruzioni del produttore.
