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1. Preparazione del sistema
- Collegare i rivelatori MALS e dRI a valle del rivelatore UV dell'FPLC. Bypassano i rivelatori di pH e conducibilità poiché aggiungeranno un volume significativo tra i rivelatori UV e MALS. Utilizzare un tubo capillare di 0,25 mm di diametro interno dalla colonna a e tra i rivelatori e un tubo capillare di 0,75 mm di diametro interno all'uscita dei rivelatori al raccoglitore di rifiuti o di frazioni.
- Assicurarsi che siano state stabilite le connessioni di segnale necessarie tra l'FPLC e i rivelatori, compresa l'uscita analogica dal rivelatore UV all'ingresso analogico MALS e l'uscita digitale dall'FPLC all'iniezione automatica MALS, tramite la scatola I/O dell'FPLC.
- Installare una colonna SEC analitica adatta che copra un intervallo di frazionamento compreso tra almeno 20 kDa e 500 kDa. Controllare le informazioni sul prodotto per determinare se la colonna è adatta all'intervallo di MW, pH e altre proprietà del campione e della fase mobile.
2. Preparazione del buffer, lavaggio del sistema durante la notte e controllo della pulizia
- Utilizzando reagenti di grado HPLC, preparare 1 L di soluzione salina tamponata con fosfato con 50-100 mM di NaCl. Filtrare il tampone a 0,1 μm utilizzando un filtro in polietere sulfone o simile. Filtrare i primi 50-100 ml di tampone in un flacone di scarto e gettarlo, al fine di eliminare il particolato dai filtri asciutti, quindi filtrare il resto in un flacone pulito e sterile che è stato lavato accuratamente con acqua filtrata e deionizzata e tappato per evitare l'ingresso di polvere><.
nota: Altri solventi in fase mobile, come un tampone Tris, possono essere utilizzati se si devono analizzare proteine aggiuntive che sono preferenzialmente disciolte in tali solventi.
- Sciacquare per una notte a una velocità di flusso di 0,5 ml/min, o come altrimenti raccomandato dal produttore della colonna, per equilibrare la colonna nel tampone e rimuovere il particolato. Utilizzare la modalità di flusso continuo dell'FPLC e assicurarsi che il flusso non si interrompa fino al completamento di tutte le esecuzioni SEC-MALS.
- Posizionare la cella di flusso dRI in modalità Purge durante il lavaggio notturno. Disattivare lo spurgo prima di iniziare le esecuzioni dei campioni.
- Quando si inizia il lavaggio, aumentare gradualmente la portata per evitare l'effetto di "distacco della colonna" (o rilascio di particelle) causato da un improvviso cambiamento di pressione nella colonna.
- Se il sistema è noto per essere abbastanza stabile e privo di particelle, e in equilibrio con la fase mobile desiderata, sostituire il lavaggio notturno con uno più breve, 2-3 ore.
- Verificare la pulizia del sistema picchiettando leggermente il tubo a valle della colonna per rilasciare le particelle accumulate e osservando il segnale nel rivelatore a 90° sul display del pannello frontale dello strumento MALS. Verificare che il rumore picco-picco non sia superiore a 50 -100 μV.
- Eseguire un'iniezione "in bianco" per verificare che l'iniettore sia pulito da particelle. Un "bianco" è semplicemente il tampone in esecuzione, preparato in una fiala fresca e sterile.
- Se il picco delle particelle non supera 1 mL in volume e non supera i 5 mV al di sopra del basale, il sistema è pronto per i campioni. In caso contrario, eseguire ulteriori iniezioni in bianco fino a quando non sono pulite o eseguire la manutenzione per pulire l'iniettore.
3. Preparazione e caricamento del campione
- Preparare almeno 200 μL di BSA a 1-2 mg/mL nel tampone SEC.
nota: Per evitare precipitazioni, la BSA non deve mai essere sciolta in acqua pura.
- Filtrare la proteina a 0,02 μm utilizzando un filtro a punta di siringa.
- Scartare le prime gocce di filtrato per eliminare le particelle dai filtri a secco.
- In alternativa, centrifugare il campione a 10.000 x g per 15 minuti per consentire la precipitazione di aggregati non solubili e altre particelle di grandi dimensioni.
- Iniettare 100 μl della soluzione BSA nell'ansa.
nota: Questa è la quantità raccomandata di materiale e può essere iniettata più o meno a seconda delle circostanze del campione, come la stabilità o la disponibilità. La quantità di proteine richiesta per iniezione varia inversamente con il peso molecolare necessaria il doppio della massa proteica se il peso molecolare è di 33 kDa o la metà di quello della BSA.
4. Preparazione del software MALS
- Apri nuovo | Sperimenta da Metodo nel menu del software MALS e seleziona il metodo online dalla cartella dei metodi del sistema Light Scattering. Se è presente un rilevatore DLS, selezionare il metodo Online dal menu Light Scattering | Con cartella QELS.
- Nella sezione Configurazione, impostare i parametri della fase campione e mobile.
- Nella vista Pompa generica, impostare la portata su quella utilizzata nell'FPLC.
- Nella visualizzazione Pompa generica, ramo solvente, campo Nome, selezionare PBS.
- Nella vista Iniettore, ramo Campione, immettere il nome come BSA e impostare dn/dc = 0,185 (il valore standard per le proteine non modificate), A2 = 0 e coefficiente di estinzione UV = 0,667 mL/(mg-cm).
nota: Per altre proteine, il coefficiente di estinzione UV280 nm può essere trovato in letteratura o calcolato dalla sua sequenza utilizzando vari strumenti software di pubblico dominio.
- Nella sezione Procedure, vista Raccolta di base, selezionare la casella di controllo Trigger on Autoinject (Attiva su iniezione automatica) e impostare la durata dell'esecuzione su 70 min in modo che i dati vengano raccolti per l'intera eluizione fino al raggiungimento del volume totale di permeazione della colonna SEC.
nota: Il tempo necessario può variare a seconda della colonna e della portata: per una colonna HPLC-SEC standard da 7,8 mm x 300 mm a 0,5 mL/min sono necessari 35 minuti di raccolta.
- Avviare l'esperimento nel software MALS facendo clic sul pulsante Esegui. Inizierà a leggere i dati dopo aver ricevuto il segnale a impulsi dallo strumento FPLC tramite il rilevatore MALS.
- Azzerare il segnale dRI facendo clic sul pulsante Autozero sul pannello frontale dello strumento.
5. Preparazione del software FPLC
- Inserire il nome della proteina e l'esecuzione nel software FPLC, in Manuale | Esecuzione di istruzioni manuali | Imposta il segno.
- Commutare la valvola di iniezione da Carico manuale a Iniezione in Percorso flusso | Valvola di iniezione.
- Includere un segnale a impulsi inserendo un impulso di 0,5 s sotto la scatola I/O | Uscita digitale a impulsi. In questo modo verrà attivata la raccolta dei dati nel software MALS.
6. Inietta il campione nel ciclo. Fare clic su Esegui nel software FPLC per avviare l'esecuzione dell'esperimento.