Purificazione di affinità di complementazione bimolecolare per isolare due proteine interagenti

Abstract

Fonte: Hastings, J. F. et al. Dissezione di complessi di segnalazione multiproteica mediante purificazione dell'affinità di complementazione bimolecolare (BiCAP). J. Vis. Exp. (2018)

In questo video, abbiamo dimostrato la purificazione dell'affinità di complementazione bimolecolare, BiCAP, per rilevare e isolare specifici dimeri proteici utilizzando anticorpi a dominio singolo specifici per la conformazione.

Protocollo

1. Coltura cellulare e trasfezione

NOTA: Per la trasfezione dei vettori BiFC è importante ottenere una trasfezione ad alta efficienza e relativamente omogenea. I vettori saranno probabilmente compatibili con qualsiasi reagente di trasfezione standard e le condizioni di trasfezione dovrebbero essere ottimizzate di conseguenza. Per eseguire la spettrometria di massa, di solito coltiviamo cellule entro piastre di 10 cm, anche se questo può anche essere proporzionalmente ridimensionato a piastre o piastre più piccole per esperimenti che richiedono meno materiale.

1. Seminare 1,0 × 10⁶ cellule HEK293T in un piatto da 10 cm con 10 mL di terreno DMEM, integrato con il 10% di FBS e Penicillina/Streptomicina (1:100).
2. Diluire 2,5 μg di ciascun vettore BiFC in 500 μL di tampone di trasfezione (vedere la Tabella dei materiali) in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
3. Aggiungere 10 μl di reagente di trasfezione (vedere la tabella dei materiali).
4. Mescolare a vortice per 10 s, quindi centrifugare brevemente. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
5. Aggiungere la miscela di trasfezione del DNA alla piastra, goccia a goccia. Incubare le cellule per un periodo di tempo sufficiente per l'interazione delle proteine di fusione BiFC e per il ripiegamento di Venere e la maturazione del fluoroforo, generalmente ~8 - 24 h.
   NOTA: Il picco di eccitazione per Venere è di 515 nm e il suo picco di emissione è di 528 nm, anche se questo è facilmente visibile utilizzando un microscopio a fluorescenza standard impostato per visualizzare la fluorescenza GFP.

2. Preparazione del Campione

1. Raccolta dei lisati
   1. Prima della raccolta del lisato, preparare il tampone di lisi cellulare [50 mM di Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM di NaCl, 1 mM di EDTA, 1% (v/v) di detergente non ionico (vedere la Tabella dei materiali)]. Conservare a 4 °C.
   2. Immediatamente prima del prelievo, integrare 10 ml di tampone di lisi cellulare con inibitore della proteasi e inibitore della fosfatasi (vedere la Tabella dei materiali). Conservare il tampone di lisi cellulare integrato sul ghiaccio.
   3. Lavare le celle due volte in PBS ghiacciato. Aspirare il PBS e aggiungere 1 mL di tampone di lisi cellulare integrato con ghiaccio freddo. Posizionare il piatto sul ghiaccio, assicurandosi che il tampone sia distribuito su tutta la superficie.
   4. Incubare su ghiaccio per circa 5 minuti, quindi utilizzare un raschietto cellulare (vedere la Tabella dei materiali) per raschiare le cellule e trasferirle in una provetta da microcentrifuga pre-raffreddata da 1,5 mL.
   5. Rimuovere i detriti cellulari centrifugando il lisato raccolto a 18.000 × g per 5 minuti a 4 °C e trasferire il surnatante chiarificato in provette fresche per microcentrifuga.
      nota: A questo punto, il lisato può essere utilizzato immediatamente, oppure conservato a -80 °C. Si raccomanda inoltre di conservare un'aliquota di lisato grezzo in modo da poter convalidare l'efficienza della trasfezione e la purificazione per affinità.
2. Purificazione per affinità
   nota: La fase di isolamento BiCAP viene eseguita utilizzando il nanocorpo GFP coniugato a perle di agarosio (vedi Tabella dei materiali).
   1. Preparare le perle di agarosio lavando un volume appropriato (20 μl per campione + 10 μl di eccesso) in 1 mL di PBS. Centrifugare le perle a 300 x g e rimuovere il surnatante.
   2. Aggiungere 20 μl a ciascun campione di lisato.
   3. Incubare i campioni per 2 ore a 4 °C con rotazione end-to-end.
      nota: A questo punto, i campioni possono essere preparati per l'SDS-PAGE e il western blotting, oppure per l'analisi mediante spettrometria di massa.
3. Preparazione dell'eluente BiCAP per western blotting.
   1. Centrifugare le perle a 300 x g e lavarle tre volte nel tampone di lisi cellulare.
   2. Risospendere le perle lavate in 50 μl di tampone per campioni opportunamente diluito (vedere la tabella dei materiali) e riscaldare i campioni a 95 °C per 2-3 min.
      nota: I campioni preparati in questo modo possono essere conservati a -20 °C per diversi mesi.
   3. Eseguire SDS-PAGE e western blotting sia per il tag V1 che per i tag V2 (vedi Tabella dei materiali), nonché per qualsiasi altra proteina di interesse.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM	Gibco	Codice 11995-073	Coltura cellulare
FBS	Tecnologie per la vita in Australia	Codice 10099-141	Coltura cellulare
Penicillina/Streptomicina	Tecnologie per la vita in Australia	Codice 15070-063	Coltura cellulare
buffer di trasfezione jetPRIME	Polyplus	114-15	Coltura cellulare
reagente di trasfezione jetPRIME	Polyplus	114-15	Coltura cellulare
PhosSTOP (inibitore della fosfatasi)	Sigma-Aldrich	4906837001	Coltura cellulare
Cocktail completo, mini, di inibitori della proteasi senza EDTA	Roche	11873580001	Articoli in plastica
Raschietto cellulare	Sarstedt	83.1832
GFP-Trap_A	Chromotek Gmbh	GTA-100	Nanocorpo GFP accoppiato a perle di agarosio
Anticorpo monoclonale GFP N-terminale	Covance	MMS-118P	Rileverà il tag V1 all'interno dei vettori BiFC
Anticorpo monoclonale GFP C-terminale	Roche	11814460001	Rileverà il tag V2 all'interno dei vettori BiFC
Tampone di campionamento	Invitrogen	NP0008	Integrato con 1 mL di β-mercaptoetanolo.
Tripsina modificata di grado sequenziale	Promega Corporation	V5117h	Coltura cellulare
Provette per microcentrifuga LoBind	Diagnostica Point of Care	Codice 0030 108 116	Articoli in plastica
Iodoacetammide	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Preparato a 5 mg/mL in acqua ultrapura
LTQ Orbitrap Velos Pro	Thermo Fisher
Celle DH5α	Thermo Fisher		Celle competenti per gli shock termici