Purificazione di affinità di complementazione bimolecolare per isolare due proteine interagenti

Abstract

Fonte: Hastings, J. F. et al. Dissezione di complessi di segnalazione multiproteica mediante purificazione dell'affinità di complementazione bimolecolare (BiCAP). J. Vis. Exp. (2018)

In questo video, abbiamo dimostrato la purificazione dell'affinità di complementazione bimolecolare, BiCAP, per rilevare e isolare specifici dimeri proteici utilizzando anticorpi a dominio singolo specifici per la conformazione.

Protocol

1. Coltura cellulare e trasfezione

NOTA: Per la trasfezione dei vettori BiFC è importante ottenere una trasfezione ad alta efficienza e relativamente omogenea. I vettori saranno probabilmente compatibili con qualsiasi reagente di trasfezione standard e le condizioni di trasfezione dovrebbero essere ottimizzate di conseguenza. Per eseguire la spettrometria di massa, di solito coltiviamo cellule entro piastre di 10 cm, anche se questo può anche essere proporzionalmente ridimensionato a piastre o piastre più piccole per esperimenti che richiedono meno materiale.

1. Seminare 1,0 × 10⁶ cellul....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	Codice 11995-073	Coltura cellulare
FBS	Tecnologie per la vita in Australia	Codice 10099-141	Coltura cellulare
Penicillina/Streptomicina	Tecnologie per la vita in Australia	Codice 15070-063	Coltura cellulare
buffer di trasfezione jetPRIME	Polyplus	114-15	Coltura cellulare
reagente di trasfezione jetPRIME	Polyplus	114-15	Coltura cellulare
PhosSTOP (inibitore della fosfatasi)	Sigma-Aldrich	4906837001	Coltura cellulare
Cocktail completo, mini, di inibitori della proteasi senza EDTA	Roche	11873580001	Articoli in plastica
Raschietto cellulare	Sarstedt	83.1832
GFP-Trap_A	Chromotek Gmbh	GTA-100	Nanocorpo GFP accoppiato a perle di agarosio
Anticorpo monoclonale GFP N-terminale	Covance	MMS-118P	Rileverà il tag V1 all'interno dei vettori BiFC
Anticorpo monoclonale GFP C-terminale	Roche	11814460001	Rileverà il tag V2 all'interno dei vettori BiFC
Tampone di campionamento	Invitrogen	NP0008	Integrato con 1 mL di β-mercaptoetanolo.
Tripsina modificata di grado sequenziale	Promega Corporation	V5117h	Coltura cellulare
Provette per microcentrifuga LoBind	Diagnostica Point of Care	Codice 0030 108 116	Articoli in plastica
Iodoacetammide	Sigma-Aldrich	I1149-5G	Preparato a 5 mg/mL in acqua ultrapura
LTQ Orbitrap Velos Pro	Thermo Fisher
Celle DH5α	Thermo Fisher		Celle competenti per gli shock termici