1. Preparazione del campione
- Purificare la biomolecola desiderata.
nota: Questo protocollo utilizza l'aptamero MN4 del DNA legante la cocaina acquistato dopo averlo scambiato con 2 M NaCl tre volte seguito da tre cicli di acqua deionizzata utilizzando un filtro centrifugo con una membrana di taglio del peso molecolare di 3 kDa.
- Sintetizzare e purificare, oppure acquistare il ligando termolabile desiderato.
nota: MN4 lega il ligando termolabile cocaina. MN4 lega anche il chinino, che viene utilizzato come controllo negativo per la termolabilità del ligando a queste temperature sperimentali.
- Preparare i tamponi per la dialisi della biomolecola purificata e la dissoluzione dei ligandi (20 mM di fosfato di sodio e 140 mM di tampone NaCl, pH 7,4, per MN4 e i ligandi qui utilizzati).
- Dializzare la biomolecola contro almeno 2 L di tampone utilizzando un tubo per dialisi con cut-off di 0,5 - 1,0 kDa.
- Filtrare il tampone finale (denominato tampone di lavoro) attraverso un filtro da 0,2 μm che è stato accuratamente bilanciato con il tampone.
- Pesare le masse desiderate dei leganti e scioglierle in un tampone di lavoro filtrato. Se le concentrazioni desiderate del ligando richiedono masse troppo piccole per essere pesate con precisione, preparare una soluzione madre concentrata di legante (10x per esempio).
nota: È fondamentale che tutti gli esperimenti DSC utilizzino lo stesso tampone di lavoro per il campione e il ligando, ovvero non eseguano mai un esperimento in cui il ligando è disciolto in un lotto diverso di tampone di lavoro rispetto alla biomolecola in quanto ciò causerà artefatti di disadattamento del tampone nei dati.
- Filtrare la soluzione madre della biomolecola attraverso un filtro da 0,2 μm che è stato accuratamente bilanciato con il tampone di lavoro.
- Determinare la concentrazione della biomolecola mediante misure di assorbanza (260 nm per gli acidi nucleici come MN4 e 280 nm per le proteine).
- Conservare la biomolecola e il ligando preparati in frigorifero a 4 °C (adatto per MN4 e i ligandi qui utilizzati), o a -20 o -80 °C se la biomolecola e i ligandi tollerano il congelamento ed è necessaria una conservazione a lungo termine. Degassare le soluzioni tampone, biomolecola e legante in un degasatore da tavolo (vedi Tabella dei materiali) prima di caricarle nel DSC.
nota: Il degasaggio aiuta a prevenire la formazione di bolle nel DSC a temperature più elevate. Le bolle causano artefatti di segnale che oscurano le forme dei picchi e le linee di base DSC.
2. Preparazione DSC
- Svitare la maniglia a pressione dal DSC (vedi Tabella dei materiali).
- Far passare il tubo in silicone dal tampone di lavoro e fissarlo alla flangia anteriore (apertura metallica) del capillare di riferimento.
- Creare un ponte tra i capillari di riferimento e quelli del campione collegando la flangia di riferimento posteriore alla flangia anteriore del campione.
- Collegare un pezzo di tubo di silicone alla flangia posteriore del campione che corre verso un pallone di scarto con una linea del vuoto collegata.
- Accendere la linea del vuoto per lavare il DSC con 200 ml di tampone di lavoro.
- Caricare il capillare di riferimento del DSC con il tampone di lavoro. Fissare sezioni di circa 3 - 5 cm di tubo in silicone alle flange capillari di riferimento.
- Inserire un puntale per pipetta da 1 ml nel tubo in silicone della flangia posteriore. Aspirare 0,8 mL di tampone di lavoro con una pipetta e inserire il puntale della pipetta con tampone nel tubo in silicone della flangia di riferimento anteriore.
- Premere delicatamente lo stantuffo della pipetta verso il basso per far passare il tampone di lavoro attraverso il tubo di silicone anteriore nel capillare di riferimento e verso l'alto nella punta della pipetta attaccata alla flangia posteriore. Premere lo stantuffo della pipetta fino a quando il livello del tampone di lavoro non raggiunge appena sopra il tubo in silicone anteriore, quindi rilasciare lo stantuffo della pipetta fino a quando il livello del tampone di lavoro non raggiunge appena sopra il tubo in silicone posteriore.
- Ripetere il passaggio del tampone di lavoro avanti e indietro per eliminare le bolle dal volume nel capillare di riferimento.
nota: Di solito, 10 passaggi della soluzione avanti e indietro sono sufficienti per eliminare eventuali bolle.
- Tappare il puntale posteriore della pipetta con il pollice e tirare delicatamente verso l'alto il puntale posteriore e la pipetta anteriore per rimuoverli dalle flange di riferimento con il tubo in silicone collegato.
- Caricare il capillare del campione con il tampone di lavoro come nei passaggi 2.6 - 2.9. Posizionare un tappo di plastica nera sulle flange posteriori di riferimento e campione, lasciando scoperte le flange anteriori.
- Fissare la maniglia a pressione.
- Aprire il software DSC (vedere la Tabella dei Materiali) e pressurizzare lo strumento facendo clic sulla freccia rossa verso l'alto nella parte superiore dell'interfaccia una volta che la lettura della potenza si è stabilizzata; la potenza DSC è indicata in una casella in alto a destra dell'interfaccia insieme alla lettura della temperatura e della pressione dello strumento.
nota: Monitorare la lettura della potenza durante la pressurizzazione del DSC. Variazioni della potenza superiori a ~ 10 μW indicano la formazione di bolle nei capillari, che può causare artefatti nei dati. Le soluzioni devono essere rimosse e ulteriormente degasate prima di continuare.
- Equilibrare il DSC con il buffer di lavoro eseguendo una scansione diretta e inversa. Nella scheda "Metodo sperimentale" sul lato sinistro dello schermo, assicurarsi che l'opzione "Scansione" sia selezionata per eseguire il DSC in modalità di scansione della temperatura.
nota: I parametri sperimentali sono l'intervallo di scansione della temperatura, la velocità di scansione, il tempo di equilibrio a bassa e alta temperatura e il numero di scansioni.
- Nel riquadro "Parametri di temperatura" nella scheda "Metodo sperimentale", fare clic sul pulsante "Riscaldamento". Inserire 1 e 100 °C per le temperature sperimentali inferiore e superiore, 1 °C/min per la velocità di scansione e 60 s per il periodo di equilibrio.
- Fare clic sul pulsante "Aggiungi serie" sotto il campo di immissione per il periodo di equilibratura. Immettere 2 nel campo "Passaggi da aggiungere" nella finestra popup (per una scansione di riscaldamento e una di raffreddamento) e selezionare la casella "Riscaldamento/Raffreddamento alternativo". Fare clic su "OK"; Le scansioni aggiunte vengono visualizzate nella parte inferiore dell'interfaccia. Verificare che i parametri per ogni scansione siano quelli desiderati.
- Inizia l'esperimento facendo clic sul pulsante verde "play" nella parte superiore dell'interfaccia. Passare alla cartella desiderata e immettere un nome file per salvare l'esperimento nella finestra popup. Per visualizzare l'avanzamento dell'esperimento, fai clic sulla scheda "Dati" a destra della scheda "Metodo dell'esperimento".
3. Raccolta di set di dati DSC di ligandi termolabili
NOTA: La procedura minima consiste in cinque esperimenti: esperimenti di riferimento tampone con e senza ligando (utilizzati per la sottrazione di base), esperimenti su campioni con la biomolecola libera, la biomolecola legata al ligando e la biomolecola legata al ligando con un periodo di equilibrio ad alta temperatura più lungo.
- Eseguire esperimenti di riferimento per la sottrazione di base dei dati di esempio. Ricaricare il DSC con il tampone di lavoro in entrambi i capillari e raccogliere più scansioni in avanti e indietro in un intervallo di temperatura adeguato a 1 °C min-1 con un tempo di equilibratura superiore (alta temperatura) di 120 s.
- Elimina le precedenti scansioni di bilanciamento del buffer dalla parte inferiore dell'interfaccia evidenziandole singolarmente e facendo clic sulla X rossa al centro a destra dell'interfaccia. Aggiungi le nuove scansioni facendo clic sul pulsante "Aggiungi serie", inserendo 20 nel campo "Passaggi da aggiungere" e selezionando la casella "Riscaldamento/Raffreddamento alternato". Fare clic su OK ed eseguire l'esperimento facendo clic sul pulsante di riproduzione verde come sopra.
- Ripetere i passaggi 3.1 - 3.1.1 con il tampone di lavoro contenente la concentrazione desiderata di ligando in entrambi i capillari per ottenere gli esperimenti di riferimento per il ligando (raccogliere due esperimenti separati utilizzando rispettivamente tempi di equilibrio ad alta temperatura di 120 s e 600 s, da utilizzare per acquisire la costante di velocità per la conversione del ligando termolabile).
nota: La velocità di scansione utilizzata qui assicura che la biomolecola negli esperimenti successivi sia in equilibrio termico nelle scansioni diretta e inversa. Velocità di scansione < 0,1 - 0,2 °C min-1 portano a termogrammi rumorosi e non sono applicabili negli esperimenti DSC. Le temperature dovrebbero estendersi da ben al di sotto della temperatura di fusione della biomolecola libera a ben al di sopra della temperatura di fusione della biomolecola satura di ligando (~ 20 - 80 °C per MN4). Verificare la riproducibilità delle scansioni (ad esempio, sono sufficienti 10 scansioni dirette e 10 scansioni inverse per un totale di 20 ).
- Se si utilizzano più ligandi (come cocaina e chinino), lavare il DSC con 200 ml di tampone di lavoro (ripetere dal passaggio 2.5) tra una corsa e l'altra per rimuovere i ligandi dai capillari e prevenire la contaminazione incrociata.
nota: È utile eseguire un esperimento di replica sulla biomolecola libera dopo un ciclo legato al ligando per verificare se il ligando precedente si adsorbe fortemente alle pareti dei capillari e non viene adeguatamente rimosso con il lavaggio del tampone. Se i termogrammi per la biomolecola libera sembrano essere spostati a una grandezza maggiore e a una temperatura di denaturazione più alta dopo l'esperimento legato al ligando, è probabile che il ligando precedente sia ancora presente nel calorimetro dopo il lavaggio. Rimuovere il ligando adsorbito incubando i capillari con il 20% di Contrad-70 per 1 ora a 60 °C con i tappi di plastica e la maniglia a pressione staccati. Nel software DSC, modificare la modalità sperimentale in "Isotermial" nella scheda Metodo sperimentale. Scegliere 3.600 s per la durata e 60 °C per la temperatura isotermica, con zero inserito per il tempo di equilibratura. Fai clic su "Aggiungi al metodo sperimentale". L'esperimento isotermico appare nella parte inferiore dello schermo. Al termine, sciacquare lo strumento con 2 L di acqua deionizzata e ripetere dal passaggio 2.5.
- Esegui esperimenti di esempio utilizzando la stessa procedura di caricamento DSC e gli stessi parametri sperimentali delle scansioni di riferimento. Per il set di dati della biomolecola libera, assicurarsi che il capillare di riferimento contenga il tampone di lavoro mentre il capillare del campione contenga la biomolecola libera alla concentrazione desiderata nel tampone di lavoro.
- Per gli esperimenti legati al ligando, assicurarsi che il ligando si trovi nel tampone di lavoro nel capillare di riferimento e che la biomolecola più il ligando si trovi nel tampone di lavoro nel capillare del campione. Lavare il sistema tra le aggiunte di diversi leganti come al punto 2.5.
- Eseguire un ulteriore esperimento con la biomolecola legata al ligando termolabile in cui il periodo di equilibrio ad alta temperatura è aumentato a 600 s e tutti gli altri parametri sperimentali sono gli stessi del passaggio 3.2.1.
nota: La durata del periodo di equilibrio ad alta temperatura per il secondo esperimento legato al ligando viene semplicemente scelta per garantire che il ligando si esaurisca più rapidamente rispetto all'esperimento con tempo di equilibrio breve. Se i picchi legati al ligando del primo esperimento decadono lentamente in funzione del numero di scansioni (ad esempio, le differenze nei massimi di picco successivi sono ≤ 0,5 °C), stimare aumenti da 10 a 20 volte nel periodo di equilibrio ad alta temperatura al fine di esaurire adeguatamente il ligando durante il secondo esperimento. Il calcolo accurato della costante di velocità per la conversione del ligando richiede che il secondo esperimento abbia una deplezione più rapida del ligando rispetto al primo. Le concentrazioni di ligandi estratte dall'analisi globale dei due esperimenti saranno simili e quindi inutilizzabili se la deplezione del ligando non è sufficientemente accelerata nel secondo esperimento.
4. Elaborazione dei dati
- Aprire i file dell'esperimento DSC nel software di analisi dei dati DSC (vedere Tabella dei materiali) ed esportare i dati grezzi sulla potenza come fogli di calcolo.
- Importa i fogli di calcolo contenenti i dati grezzi sulla potenza nel software per l'adattamento dei dati.
- Baseline sottrarre i dati del campione sottraendo i dati sulla potenza del tampone dagli esperimenti di biomolecole libere e legate al ligando.
nota: Per l'esperimento del ligando termolabile, la concentrazione del ligando iniziale diminuisce ad ogni scansione. Pertanto, è ideale sottrarre la scansione del buffer 1 dalla scansione del campione 1 e così via. Abbiamo scoperto che le scansioni tampone con cocaina non cambiano in modo apprezzabile man mano che la conversione del ligando procede e quindi una singola scansione del tampone ligando termolabile può essere utilizzata per sottrarre tutti i dati legati al ligando termolabile.
- Convertire i dati di potenza del campione sottratti dalla linea di base in capacità termica.
nota: La conversione richiede il volume specifico parziale della biomolecola, che può essere stimato.
5. Analisi dei dati
- Globalmente adatta il set di dati sulla capacità termica legata al ligando termolabile a breve tempo di equilibrio con un singolo set di parametri di base, concentrazione del ligando, ripiegamento e legame del ligando.
- Ripetere l'adattamento globale per il set di dati del tempo di equilibrio lungo per calcolare la costante di velocità per la conversione del ligando termolabile.
