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1. Preparazione di CXCL12, tampone di saggio e cellule Jurkat per il saggio di legame della competizione
- Preparare una soluzione madre di CXCL12AF647 (20 μg/mL; vedere la Tabella dei materiali e dei reagenti) sciogliendo il reagente liofilizzato (conservato a -80 °C, al buio) in acqua ultrapura integrata con lo 0,01% (volume/volume) di Polisorbato 20. Conservare le aliquote monouso di questa soluzione madre a -80 °C, al riparo dalla luce.
- Preparare il tampone del saggio aggiungendo 40 mL di HEPES (1 M, concentrazione finale 20 mM) a 200 mL di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS, 10x, senza rosso fenolo e senza bicarbonato di sodio, 1x concentrazione finale). Aggiungere acqua ultrapura fino ad ottenere un volume finale di 2 L. Aggiungere 4 g (0,2% peso/volume) di albumina sierica bovina (BSA) e sciogliere la BSA mediante agitazione magnetica. Infine, regolare il pH a 7,4 (utilizzare NaOH per questo) e filtrare la soluzione attraverso pori di 0,2 μm (vedi Tabella dei materiali e dei reagenti) utilizzando un collettore a vuoto.
NOTA: Questo tampone di analisi verrà utilizzato in tutte le fasi successive del protocollo.
- Conta il numero e la vitalità delle cellule Jurkat. A tal fine, prelevare un campione della sospensione cellulare e diluirlo in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
nota: Utilizziamo abitualmente un analizzatore automatico di vitalità cellulare (vedi Tabella dei materiali e dei reagenti) in grado di contare le sospensioni cellulari a concentrazioni variabili. Per la conta cellulare, diluire 0,5 mL di sospensione cellulare in 1,5 mL di PBS (sono possibili anche altre diluizioni, ad es. 0,1 mL in 1,9 mL di PBS). Sono disponibili in commercio diversi altri dispositivi per il conteggio del numero di cellule e della vitalità che dovrebbero funzionare altrettanto bene.
- Raccogliere il numero desiderato di cellule (ad esempio, ~24 x 106 cellule per eseguire il test con una piastra completa da 96 pozzetti) in una provetta sterile da 50 mL mediante centrifugazione (vedere la tabella dei materiali e dei reagenti per il tipo di centrifuga utilizzata) a 400 x g per 5 minuti a RT.
- Versare delicatamente il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Aggiungere un tampone di analisi fresco (ad es. 20 mL) e risospendere le cellule pipettando delicatamente su e giù.
- Centrifugare nuovamente le celle a 400 x g per 5 minuti a RT.
- Versare nuovamente il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un tampone di saggio fresco per ottenere una densità di 5 x 106 cellule/mL.
2. Saggio vincolante per la competizione
NOTA: Il test di legame della competizione effettivo viene eseguito a RT e può essere eseguito in condizioni non sterili.
- Diluire i composti in esame in tampone di saggio (vedere 1.2) per ottenere la concentrazione desiderata. Preparare una concentrazione fissa di composto per lo screening iniziale (ad esempio, concentrazione finale di 10 μM) o, in alternativa, una serie di concentrazioni di diluizione seriale per una caratterizzazione più dettagliata dei composti (ad esempio, una serie di diluizioni di 1/3, 1/4 o 1/5 a partire da 1 μM, concentrazione finale). Tieni presente che la soluzione composta alla fine verrà diluita 2 volte nel saggio; Pertanto, preparare una soluzione concentrata 2x.
- Erogare 100 μl di soluzione composta (2x concentrata) in una piastra di fondo rotonda trasparente a 96 pozzetti (vedere la tabella dei materiali e dei reagenti) secondo un layout sperimentale predefinito (ad esempio, Figura 1C).
NOTA: In questa fase, i campioni di controllo negativi e positivi sono inclusi nel test. Nel campione di controllo negativo, al posto del composto vengono aggiunti 100 μl di tampone di analisi ai pozzetti della piastra a 96 pozzetti. Per il campione di controllo positivo, durante questa fase viene aggiunto anche un tampone di analisi. Vedere anche la Figura 1C per un tipico layout sperimentale in cui viene testata una serie di diluizioni di diversi composti.
- Aggiungere 50 μl di sospensione cellulare (vedere 1.7; 0,25 x 106 cellule) da un serbatoio di reagenti nella piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale. Incubare la piastra per 15 minuti a RT al buio.
- Aggiungere 50 μL di CXCL12 marcato in fluorescenza (ovvero 100 ng/mL di CXCL12AF647 in tampone di saggio, 4 volte concentrato, concentrazione finale di 25 ng/mL) da un serbatoio di reagente simile ai pozzetti della piastra a 96 pozzetti. Incubare per 30 minuti a RT al buio.
nota: Per i campioni di controllo negativi, aggiungere invece il tampone di saggio. Pertanto, il segnale fluorescente rilevato nei campioni di controllo negativi corrisponderà al segnale di fondo autofluorescente (Figura 1A). Per i campioni di controllo positivi, aggiungere 50 μL/pozzetto di CXCL12AF647. I campioni di controllo positivi produrranno il segnale di fluorescenza massimo rilevato poiché non è stata inclusa alcuna potenziale inibizione mediante pre-incubazione con composti (Figura 1A).
- Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 400 x g per 5 minuti a RT. Rimuovere il surnatante dalle celle pellettate capovolgendo la piastra. Asciugare la piastra su un fazzoletto.
- Aggiungere 200 μl di tampone di saggio fresco da un serbatoio di reagenti ai pozzetti utilizzando una pipetta multicanale. Procedere immediatamente.
- Centrifugare nuovamente la piastra per 5 minuti a 400 x g a RT. Rimuovere il surnatante capovolgendo la piastra e asciugarla nuovamente su un fazzoletto.
- Risospendere delicatamente il pellet cellulare in 200 μL di paraformaldeide all'1% disciolta in PBS. Questo passaggio riparerà le celle.
- Proseguire immediatamente il protocollo con la quantificazione della fluorescenza mediante citometria a flusso.
3. Analisi dei campioni mediante citometria a flusso
CXCL12 Le cellule colorate e fissateAF647 sono ora pronte per essere analizzate utilizzando la citometria a flusso. Possono essere utilizzati diversi tipi di citometri a flusso, ma devono essere dotati del laser corretto (ad esempio, un laser rosso, intervallo di eccitazione ~630 nm) per l'eccitazione e di filtri adatti per la rilevazione dei fluorofori (filtri di emissione ~660 nm). Devono essere in grado di gestire campioni in un formato di piastra a 96 pozzetti. Esempi di dispositivi di citometria a flusso adatti sono riportati nella Tabella dei materiali e dei reagenti.
- Avviare il dispositivo e aprire il software corrispondente (vedere la tabella dei materiali e dei reagenti).
- Selezionare i seguenti parametri cellulari da visualizzare in un formato dot blot: diffusione diretta (FSC), diffusione laterale (SSC) e canale di rilevamento del fluoroforo (CXCL12AF647><).
nota: Con il parametro FSC, le cellule vengono discriminate in base alle loro dimensioni, poiché l'assorbimento della luce rilevato è proporzionale al diametro della cella. Il parametro SSC, che misura la diffusione della luce con un angolo di 90°, fornisce informazioni sulla granularità delle celle.
- Scegliere un campione (ad esempio, un campione di controllo negativo) per eseguire il gating di una popolazione cellulare omogenea definita in base ai parametri FSC e SSC.
- Selezionare l'iniezione automatica di ~100 μL di cellule fissate da questo campione di controllo negativo nel citometro a flusso. Selezionare l'opzione "miscelazione" prima dell'iniezione e utilizzare una portata del campione di 1,5 μl/s.
- Eseguire questo esempio selezionando "Acquisisci dati". I parametri FSC e SSC per questo campione verranno visualizzati sullo schermo.
- Seleziona lo strumento di gating del software. Sulla base della visualizzazione del dot blot FSC e SSC, è possibile predefinire una popolazione cellulare omogenea e vitale mediante gating. Per fare ciò, crea un poligono (utilizzando lo strumento di gating del software) che includa le singole celle distribuite in modo omogeneo ("eventi") in base a queste due dimensioni.
nota: La procedura di gating mira a definire una popolazione cellulare omogenea e vitale che verrà utilizzata per ulteriori analisi. Il gating si basa sul presupposto che la maggior parte delle cellule vitali formerà una popolazione cellulare omogenea basata sui parametri FSC e SSC. Eseguendo questo passaggio, i detriti cellulari, le cellule morte e gli aggregati cellulari possono essere in gran parte esclusi da ulteriori analisi. Un'illustrazione del processo di iniezione è fornita nella Figura 1B.
- Selezionare questa opzione per analizzare 20.000 "eventi" (ad esempio, singole cellule) per campione.
nota: Ciò significa che per ogni campione verranno analizzate 20.000 cellule che rientrano nel gate predefinito. L'acquisizione dei dati per ogni campione continuerà fino all'analisi di questo numero di eventi.
- Avviare la corsa (selezionare "Registra dati"). Il dispositivo di citometria a flusso analizzerà ora tutti i campioni uno per uno registrando l'intensità media di fluorescenza (MFI) per ciascun campione. Questa MFI corrisponde al segnale fluorescente medio corrispondente alle 20.000 celle che rientrano nel gate predefinito.
