1. Generazione di un plasmide che esprime il costrutto chimerico
NOTA: L'obiettivo è generare un plasmide che esprima il dominio extracellulare del recettore di interesse fuso ai domini transmembrana e intracellulari della catena CD3ζ del topo (Figura 1A).
- Recuperare la sequenza del dominio extracellulare del recettore di interesse, incluso il peptide segnale. Ottenere materiale di DNA che si prevede esprima questo recettore (ad esempio, cDNA o un plasmide).
- Ottenere materiale di DNA che esprime la transmembrana e i domini intracellulari della catena CD3ζ del topo (ad esempio, cDNA o un plasmide).
- Progetta la sequenza della proteina di fusione in base alla struttura generale mostrata nella Figura 1A. Assicurarsi che l'intera sequenza si trovi all'interno dello stesso frame di lettura del codone. Questa sequenza viene utilizzata per progettare primer appropriati e verificare il prodotto finale.
- Progettare due reazioni di PCR per amplificare separatamente ciascuno dei frammenti delle proteine di fusione (Figura 1B, 1C).
nota: Le condizioni specifiche per le reazioni di PCR (ad esempio, il tempo di allungamento e la temperatura di ricottura) dipendono dalla natura dei primer, che sono progettati per un recettore specifico.
- Amplifica il segmento extracellulare del recettore.
- Progettare un primer 5' che includa parte del peptide segnale del recettore, una sequenza consenso di Kozak e un sito di restrizione appropriato (Figura 1B).
- Progettare un primer da 3' che fiancheggia entrambe le parti della proteina di fusione (Figura 1B). Ad esempio, per il disegno iniziale, questo primer 3' può includere le ultime 20 paia di basi del segmento extracellulare del recettore e le prime 9 paia di basi del segmento CD3ζ.
nota: Non è necessario aggiungere un sito di restrizione al primer 3' poiché questo primer verrà utilizzato per generare la sequenza fusa e non viene utilizzato per la legatura.
- Amplifica il segmento CD3ζ.
- Progettare un primer da 5' che fiancheggia entrambe le parti della proteina di fusione (Figura 1C). Ad esempio, per il disegno iniziale, il primer 5' può includere le ultime 9 paia di basi del segmento extracellulare del recettore e le prime 20 paia di basi del segmento CD3ζ.
nota: Non è necessario aggiungere un sito di restrizione al primer 5' poiché questo primer verrà utilizzato per generare la sequenza fusa e non viene utilizzato per la legatura.
- Progettare un primer da 3' che includa la fine della sequenza CD3ζ e un sito di restrizione appropriato (Figura 1C).
- Correggere le sequenze di primer in ciascuna di queste due reazioni in modo che la temperatura di ricottura sia simile in ogni coppia (si noti che il primer, che include le sequenze delle due parti della proteina di fusione, ricuoce solo con una parte della sequenza in ogni reazione).
- Eseguire un'ulteriore PCR in cui una miscela dei prodotti della PCR delle prime due reazioni viene utilizzata come stampo del DNA con il primer 5' del segmento del recettore extracellulare (passaggio 1.4.1.1) e il 3' del segmento CD3ζ (passaggio 1.4.2.2) (Figura 1D). Questa reazione dovrebbe generare la sequenza finale fusa.
- Procedere come di consueto per la clonazione.
- Legare il prodotto finale della PCR al vettore di taglio target (il vettore target è solitamente pcDNA3 che esprime resistenza a G418 e ampicillina).
- Trasforma il vettore legato in batteri competenti.
- Scongelare 50 μL dei batteri competenti sul ghiaccio.
- Aggiungere il vettore legato ai batteri e incubare con ghiaccio per 20 minuti.
- Incubare a 42 °C per 45 s.
- Aggiungere 200 μL di LB senza antibiotici.
- Incubare per 1 ora a 37 °C agitando continuamente.
- Seminare su una piastra LB con gli antibiotici appropriati (ad esempio, soluzione di ampicillina con una concentrazione finale di 0,1 mg/mL).
- Raccogliere e far crescere diverse colonie batteriche in 5 mL di LB (in provette da 15 mL).
- Il giorno successivo, estrai i plasmidi con un mini-kit di preparazione.
- Analizzare l'inserto genico con enzimi di restrizione.
- Sequenziare le colonie pertinenti e verificare che la sequenza e il frame di lettura siano corretti (come indicato al punto 1.3).
- Trasforma il plasmide verificato in batteri competenti.
- Scongelare 20 μl dei batteri competenti sul ghiaccio.
- Aggiungere 1 μL di plasmide ai batteri e incubare su ghiaccio per 20 minuti.
- Incubare a 42 °C per 45 s.
- Aggiungere 200 μL di LB senza antibiotici.
- Incubare per 1 ora a 37 °C agitando continuamente.
- Seminare su una piastra di crescita batterica con gli antibiotici appropriati (ad esempio, soluzione di ampicillina con una concentrazione finale di 0,1 mg/mL).
- Il giorno successivo, far crescere una colonia batterica in un grande contenitore LB con 0,1 mg/mL di ampicillina (~250 mL).
- Il giorno successivo, eseguire la maxi preparazione secondo le istruzioni specifiche fornite dal kit.
nota: Per la procedura di elettroporazione è necessaria una grande quantità di plasmide, come descritto di seguito.
2. Trasfezione del plasmide che esprime la proteina chimerica in cellule BW
NOTA: Diversi metodi possono essere impiegati anche per la trasfezione (ad esempio, per infezione lentivirale). Prima dell'elettroporazione, eseguire la precipitazione con etanolo del DNA come descritto di seguito. I passaggi successivi richiedono condizioni sterili.
- Il giorno prima, preparare le celle BW5147 ("celle BW") per l'elettroporazione. Piastra 10 piastre (da 10 cm) con 10 mL di 100.000 BW5147 cellule/mL (cioè, un totale di 10 x 106 cellule) con RPMI integrata con il 10% di siero fetale di vitello (FCS), l'1% di piruvato di sodio, l'1% di L-glutammina, l'1% di aminoacidi non essenziali e l'1% di penicillina-streptomicina ("terreno completo").
- Posizionare 100 μg del plasmide pcDNA3 che esprime la proteina di fusione in una provetta da 1,5-2 ml e aggiungere 3 M di acetato di sodio a pH 5,3-5,5. Il volume dell'acetato di sodio dovrebbe corrispondere allo 0,1 (10%) del volume del plasmide da 100 μg; Titola il pH dell'acetato di sodio con un pHmetro aggiungendo NaOH o HCl.
- Aggiungere 2,5 volumi di etanolo al 100% alla miscela del plasmide e dell'acetato di sodio come descritto nella fase 2.2 (2,5 volte il volume totale del plasmide e dell'acetato di sodio). Incubare per una notte a -20 °C o per 2 ore a 70 °C.
- 24 ore dopo la piastratura delle celle BW, raccogliere tutte le cellule BW (~100 mL) in 2 provette da 50 mL. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 515 x g ed eliminare il surnatante.
- Risospendere il pellet da entrambe le provette in 25 mL di RPMI- in un'unica provetta da 50 mL. Ad esempio, risospendere il pellet di una provetta con 25 mL di RPMI- e quindi utilizzare questo fluido per risospendere il fluido nell'altra provetta da 50 mL in modo che il pellet totale delle celle BW venga ri-sospeso in 25 mL di terreno in una singola provetta.
nota: Il terreno deve essere senza aggiunte poiché il siero potrebbe interferire con l'elettroporazione.
- Centrifugare nuovamente le celle per 5 minuti a 515 x g. Risospendere il pellet in 1 mL di RPMI e trasferire il contenuto in una cuvetta da 0,4 cm con ghiaccio.
- Centrifugare il plasmide che ha subito la precipitazione dell'etanolo (Fase 2.3) per 30 minuti a 16.000 x g e 4 °C.
- Lavare una volta con 1 ml di etanolo al 70% e centrifugare per altri 20 minuti a 16.000 x g e 4 °C (per lavare via il sale).
- Rimuovere tutto l'etanolo e lasciare asciugare leggermente il pellet (cioè in una provetta aperta nella cappa di coltura tissutale). Risospendere il pellet con 100 μL di RPMI- precedentemente riscaldato a 60 °C.
- Aggiungere il plasmide risospeso (Passaggio 2.8) alle cellule nella cuvetta e incubare per 5 minuti su ghiaccio.
- Elettroporare le celle a 0,23 kV, 250 capacitazione. Questa operazione dovrebbe richiedere ~4 ms.
- Trasferire le celle elettroporate in una provetta da 50 mL, aggiungere 50 mL di terreno completo e centrifugare per 5 minuti a 5,15 x g.
- Scartare il surnatante e risospendere le cellule con 50 mL di terreno completo.
- Piastra le cellule elettroporate in piastre di coltura da 24 pozzetti (1 mL per pozzetto, per un totale di ~50 pozzetti) e incubazione a 37 °C e 5% di CO2 per 48 ore.
- Selezionare le cellule trasfettate con antibiotici. Dopo 48 ore aggiungere 1 mL di terreno completo integrato con 10 mg/mL G418 a ciascun pozzetto (in questa fase il volume finale in ciascun pozzetto è di 2 mL e la concentrazione finale di G418 in ciascun pozzetto è di 5 mg/mL).
nota: Se il plasmide contiene una diversa resistenza agli antibiotici, determinare la concentrazione di antibiotico necessaria per uccidere le cellule BW non trasfettate prima di questo passaggio.
- Ogni 48 ore, scartare con cura 1 mL del volume superiore di ciascun pozzetto senza mescolare il terreno nel pozzetto (le celle del peso corporeo tendono a trovarsi sul fondo del pozzetto). Aggiungere un terreno completo addizionato con 5 mg/mL di G418 a ciascun pozzetto, in modo che il volume finale in ciascun pozzetto sia di nuovo 2 mL.
- Esaminare regolarmente le piastre di coltura per la crescita cellulare in tutti i pozzetti.
nota: Un cambiamento nel colore del terreno in giallo può aiutare a identificare le cellule in crescita; tuttavia, all'inizio, il mezzo sarà giallo a causa del G418 stesso. Identificare i pozzetti positivi (pozzetti con cellule in crescita). Questi pozzetti sono resistenti a G418 e quindi ci si aspetta che esprimano la proteina di fusione. Questo processo richiede solitamente ~3 settimane.
3. Verifica dell'espressione del recettore trasfettato nelle cellule nei pozzetti positivi.
- Colorare le cellule BW trasfettate con un anticorpo specifico contro il recettore che è stato trasfettato.
- Confrontare il livello di espressione del recettore mediante citometria a flusso con l'espressione delle cellule di controllo (cellule BW non trasfettate).
- Dopo la verifica di uno o più pozzetti, utilizzare immediatamente le cellule per scopi sperimentali, farle crescere in coltura o congelarle per applicazioni future.
- Verificare l'espressione del recettore trasfettato prima di eseguire un nuovo esperimento. Dopo alcune settimane di crescita, le cellule con G418 con un'espressione recettore stabile, G418, possono essere omesse dal terreno di coltura.
4. Incubazione delle cellule BW trasfettate con bersagli
NOTA: Quando si utilizzano le cellule BW trasfettate per la prima volta, è preferibile testarle su bersagli che esprimono un ligando noto del recettore di interesse o su anticorpi legati alla piastra specificamente diretti contro il recettore di interesse (esperimenti di cross-linking; vedi sotto, sezione 4.2.1.3).
- Preferibilmente, dividere le cellule BW 24 ore prima dell'esperimento (ad esempio, aggiungendo 10 mL di terreno completo a 2 mL di cellule in coltura in una nuova piastra di coltura da 10 cm).
- Incubare le cellule BW trasfettate con i loro bersagli. Eseguire l'esperimento contemporaneamente su cellule BW di controllo che esprimono un vettore vuoto (o cellule BW parentali). Le piastre 96F sono preferibili (ma possono essere utilizzate anche le piastre 96U). Esegui l'esperimento in triplice copia. Sospendi tutte le cellule nel mezzo completo.
- Prepara gli obiettivi. Il tipo di bersaglio varia in funzione dell'obiettivo e può essere costituito da cellule, cellule che sono state pre-incubate con anticorpi o solo anticorpi. Questo sistema è stato utilizzato anche con i batteri come bersagli.
- Se i bersagli sono cellule in divisione (cioè linee cellulari), irradiarle a 6.000 rad prima del saggio. Posizionare 50.000 cellule bersaglio in un singolo pozzetto di una piastra da 96 (in un volume di 100 μl).
- Per gli esperimenti con anticorpi e cellule BW che esprimono FcγR umane, incubare le cellule bersaglio con un anticorpo su ghiaccio in una piastra a 96 pozzetti (ad esempio, 50 μL delle cellule bersaglio e 50 μL dell'anticorpo; possono essere testate diverse dosi di anticorpi).
- Se si utilizzano solo anticorpi come bersagli (esperimenti di reticolazione), questi devono essere legati alla piastra. A tale scopo, incubare prima gli anticorpi in un terreno completo in una piastra 96F per 1-2 ore a 37 °C e 5% di CO2 (una dose iniziale tipica è di 0,5 μg di un anticorpo specifico in 50 μL). Lavare la piastra per rimuovere gli anticorpi non legati.
nota: In questo caso, una piastra 96F consentirà il legame dell'anticorpo alla piastra, che dopo l'aggiunta delle cellule BW trasfettate porterà all'attivazione del recettore trasfettato.
- Aggiungi le celle BW (celle effettrici). Collocare 50.000 cellule BW in un singolo pozzetto di una piastra da 96 (in un volume di 100 μl).
- Se necessario, completare il volume in ciascun pozzetto a 200 μl.
- Incubare le piastre a 37 °C e 5% di CO2 per 48 ore (questo periodo di tempo può essere calibrato).
- Dopo 48 ore, congelare le piastre a -20°C e scongelarle prima dell'ELISA, oppure utilizzarle immediatamente per l'ELISA (vedere i passaggi successivi).
5. ELISA
- Rivestire una piastra ELISA con un anticorpo anti-topo IL-2 (anti-mIL-2). Posizionare 0,05 μg di anti-mIL-2 in un volume di 50 μL di 1x PBS (soluzione salina tampone fosfato) per pozzetto. Incubare la piastra ELISA rivestita con l'anticorpo anti-mIL-2 a 4 °C durante la notte o a 37 °C per 2 h.
nota: Per eseguire l'ELISA direttamente dopo la fase di incubazione, la piastra ELISA deve essere rivestita 24 ore prima della fine del periodo di incubazione delle cellule BW.
- Eliminare il fluido nella piastra ELISA e aggiungere una soluzione bloccante (200 μL per pozzetto) composta da 1x PBS e 1% di albumina sierica bovina (BSA). Incubare la piastra ELISA per 2 ore a temperatura ambiente.
- Lavare la piastra ELISA tre volte con una soluzione di PBS Tween allo 0,05% (cioè 0,5 ml di Tween-20 in 1 litro di 1x PBS).
- Prendiamo la piastra 96 che contiene le cellule BW che sono state incubate con i loro bersagli (4.3). Se la piastra è stata congelata, scongelarla completamente (ad es. mediante breve incubazione a 37 °C). Centrifugare la piastra a 96 pozzetti (5 min, 515 x g) e trasferire con cura 100 μl di surnatante in ciascun pozzetto alla piastra ELISA pre-rivestita e bloccata.
nota: Il surnatante deve essere raccolto dai lati di ogni pozzetto per evitare di prendere le cellule.
- Se lo si desidera, aggiungere mIL-2 ricombinante con concentrazioni definite a una delle file vuote della piastra ELISA rivestita per generare una curva standard di mIL-2. Ad esempio, iniziare da una concentrazione di mIL-2 di 2.500 pg/mL e poi diminuire del 50% in ogni pozzetto successivo; non aggiungere mIL-2 all'ultimo pozzetto.
- Incubare la piastra ELISA a 4 °C per una notte o a 37 °C per 2 ore.
- Lavare la piastra ELISA quattro volte con PBS Tween.
- Aggiungere la biotina anti-topo IL-2 alla piastra ELISA. Utilizzare una concentrazione di 1 μg di anticorpo in 1 mL di 1x PBS con 1% di BSA e dividere in 100 μL per pozzetto.
- Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
- Lavare la piastra ELISA sei volte con PBS Tween.
- Aggiungere streptavidina coniugata HRP. Utilizzare una concentrazione di 1 μL di streptavidina in 1 mL di PBSX1 con l'1% di BSA e dividerla in 100 μL per pozzetto.
- Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
- Lavare la piastra ELISA sei volte con PBS Tween.
- Aggiungere 100 μl per pozzetto di soluzione di substrato TMB. Completare rapidamente questa fase per ridurre al minimo le differenze tra i pozzetti dovute a ritardi nell'aggiunta del TMB.
- Leggere la targa ELISA con un lettore di piastre ELISA a 650 nm (la lettura può essere ripetuta se il segnale è debole).
