Sonda di forza biomembrana per quantificare le interazioni recettore-ligando

Abstract

Fonte: Chen, Y., et al., Fluorescence Biomembrane Force Probe: Quantificazione concomitante della cinetica recettore-ligando e segnalazione intracellulare indotta dal legame su una singola cellula. (2015)

In questo video, le sonde di forza a biomembrana (BFP) vengono utilizzate per misurare le forze tra recettori e ligandi. Questa tecnica è in grado di rilevare le interazioni monitorando la pressione necessaria per rompere i legami tra il pMHC coniugato sulle perle della sonda e i TCR sulle cellule bersaglio.

Protocollo

1. Isolamento, biotinilazione e regolazione dell'osmolarità dei globuli rossi umani

NOTA: Il passaggio 1.1 dovrebbe essere eseguito da un professionista medico qualificato come un infermiere, con un protocollo approvato dall'Institutional Review Board.

1. Prelevare 8-10 μl (una goccia) di sangue da una puntura del dito e aggiungerlo a 1 ml di tampone carbonato/bicarbonato (Elenco dei materiali). Agitare delicatamente o pipettare la miscela e centrifugare per 1 minuto a 900 x g. Scartare il surnatante e lavare ancora una volta.
2. In un piccolo becher pesare 3,5-4 mg di linker Biotina-PEG3500-NHS (Elenco dei materiali). Scioglierlo nel tampone carbonato/bicarbonato per ottenere la concentrazione finale di 3 mg/ml.
3. Miscelare 171 μl di tampone carbonato/bicarbonato, 10 μl di confezione di globuli rossi e 1049 μl di soluzione linker biotina-PEG3500-NHS e incubare a RT per 30 minuti. Lavare i globuli rossi una volta con tampone carbonato/bicarbonato e poi due volte con tampone N2-5% (Elenco materiali).
4. Nel frattempo, mettere il flacone di collegamento con il tappo allentato in un essiccatore sottovuoto di vetro riempito di essiccanti sul fondo e aspirare per 5 minuti e riempire l'essiccatore con argon. Stringere il tappo ed estrarre la bottiglia. Sigillare il flacone con un film di plastica paraffina (Lista dei materiali), metterlo in un contenitore pieno di essiccanti sul fondo e conservarlo a -20 °C.
   nota: Le fasi che prevedono l'uso del linker Biotin-PEG3500-NHS, incluso 1.2-1.4 (ad eccezione dell'incubazione e del lavaggio in 1.3), devono essere eseguite il più rapidamente possibile.
5. Diluire la nistatina in tampone N2-5% per ottenere una concentrazione finale di 40 μg/ml. Miscelare 5 μl di globuli rossi biotinilati con 71,4 μl di soluzione di nistatina (Elenco dei materiali) e incubare per 1 ora a 0 °C. Lavare due volte con tampone N2-5% e conservare con tampone N2-5% + 0,5% BSA (Elenco materiali) in frigorifero (4 °C).

2. Silanizzazione di perline di vetro

1. Pulizia della superficie del tallone
   1. Pesare 50 mg di polvere di perle di vetro e risospenderle in 500 μl di acqua deionizzata.
   2. Mescolare 0,5 ml di 30% H₂O₂ (Lista dei materiali) con 9,5 ml di acqua deionizzata in un becher da 50 ml, quindi aggiungere 2 ml di NH₄OH concentrato (Lista dei materiali) e portare questa soluzione in una caldaia su una piastra calda.
   3. Aggiungere le perle di vetro alla soluzione bollente e continuare a far bollire per altri 5 minuti. Agitare delicatamente la soluzione ogni minuto.
   4. Dopo l'ebollizione, trasferire ~5 ml di questa sospensione di perle calde in una provetta per microcentrifuga da 15 ml e rabboccare con acqua RT DI. Centrifugare a 3.500 x g per 5 min, rimuovere ed eliminare il surnatante.
   5. Trasferire altri 5 ml di sospensione di perle calde e aggiungerle alle perle lavate, rabboccare con altra acqua deionizzata, mescolare bene e centrifugare di nuovo. Ripetere questa procedura fino a quando non vengono utilizzati circa 50 ml di acqua deionizzata, che saranno un totale di 4 o 5 lavaggi
   .
   6. Trasferire la sospensione di perline in un flaconcino da 1 ml. Ripetere il lavaggio delle perle con metanolo (Lista dei materiali) mediante centrifugazione a 17.000 x g per 5 minuti 3 volte, e infine risospendere le perle in 1 ml di metanolo al 100%.
2. Tiolazione della superficie del tallone
   1. In una provetta da centrifuga da 50 ml aggiungere 45,6 ml di metanolo, 0,4 ml di acido acetico (Elenco dei materiali), 1,85 ml di acqua deionizzata deionizzata, 1,15 ml di 3-Mercaptopropiltrimetossisilano (MPTMS) (Elenco dei materiali) e 1 ml di sospensione di perle preparata in 2.1, quindi incubare a RT per 3 ore.
   2. Dopo la reazione, rimuovere tutti i reagenti lavandoli una volta con metanolo fresco e risospendere le perle in 500 μl di metanolo. Dividere uniformemente questa sospensione concentrata di perle di vetro in un set di 20 fiale di vetro asciutte e pulite con tappi a vite. Evaporare il metanolo utilizzando un getto di argon secco e ruotare lentamente le fiale in modo da formare un sottile strato di perle secche sui lati di ogni fiala.
   3. Mettere le fiale di perle in un forno di essiccazione preriscaldato a 120 °C per 5 minuti, quindi estrarre e posizionare rapidamente il tappo o i tappi. Mettere le fiale in un essiccatore sottovuoto di vetro riempito di essiccanti sul fondo e aspirare l'essiccatore con una pompa a vuoto fino a quando non si sarà raffreddato.
   4. Spurgare l'essiccatore sottovuoto con argon secco per portare l'essiccatore alla normale pressione atmosferica. Rimuovere il coperchio dell'essiccatore e serrare rapidamente il tappo o i tappi del flaconcino. Sigillare le fiale con pellicola di plastica di paraffina e conservarle in RT in una scatola di conservazione asciutta e scura.
   5. Al momento dell'uso immediato, prelevare una fiala di perle asciutte e lavare una volta con tampone fosfato (Elenco dei materiali), risospendere in 50 μl di tampone fosfato e conservare a 4 °C. Questa preparazione concentrata di perle sarà indicata come "perline MPTMS" nei passaggi seguenti.
      nota: Con una corretta conservazione, le perle MPTMS potrebbero rimanere funzionanti fino a tre mesi.

3. Funzionalizzazione delle perline

1. Rivestimento covalente di proteine su perline
   1. Prelevare un certo volume (ad esempio, 2,5 μl) dello stock proteico e mescolarlo con un volume uguale di tampone carbonato/bicarbonato per ottenere la soluzione 1.
      nota: Il volume dipende dalla concentrazione del brodo e dalla densità del sito finale desiderata della proteina sulla superficie delle perle.
   2. In un piccolo becher pesare 2-3 mg di linker MAL-PEG3500-NHS (Material list) e scioglierlo con tampone carbonato/bicarbonato per raggiungere una concentrazione finale di 0,231 mg/ml.
   3. Miscelare la soluzione 1 con un volume uguale della soluzione linker preparata al punto 3.1.2. Incubare la miscela a RT per 30 minuti per ottenere la Soluzione 2.
   4. Nel frattempo, mettere il flacone di collegamento con il tappo allentato in un essiccatore sottovuoto di vetro riempito di essiccanti sul fondo e aspirare per 5 minuti e riempire l'essiccatore con argon. Stringere il tappo ed estrarre la bottiglia. Sigillare il flacone con pellicola di plastica, metterlo in un contenitore riempito di essiccanti sul fondo e conservare a -20 °C.
      nota: Le fasi che prevedono l'uso del linker MAL-PEG3500-NHS, inclusi i punti 3.1.2-3.1.4 (ad eccezione dell'incubazione in 3.1.3), devono essere completate il più rapidamente possibile.
   5. Miscelare 5 μl di microsfere di MPTMS con la soluzione 2 e aggiungere il tampone fosfato (elenco dei materiali) per ottenere un volume finale di 250 μl.
   6. Incubare le perle per una notte a RT, lavare 3 volte con tampone fosfato e risospendere in 100 μl di tampone fosfato e conservare a 4 °C.
2. Preparazione di perle rivestite di proteine/streptavidina (SA)
   1. Seguire il protocollo 3.1.1-3.1.4.
   2. Miscelare 5 μl di perle di MPTMS con la soluzione 2 e 5 μl di soluzione 4 mg/ml di streptavidina-maleimmide (SA-MAL) (elenco dei materiali) e quindi aggiungere il tampone fosfato per ottenere un volume finale di 250 μl.
   3. Incubare le perle per una notte a RT, lavare 3 volte con tampone fosfato e infine risospendere in 100 μl di tampone fosfato e conservare a 4 °C.
3. Rivestimento di streptavidina su perle di vetro
   1. Mescolare 5 μl di perle di MPTMS con 5 μl di soluzione SA da 4 mg/ml e aggiungere 140 μl di tampone fosfato.
   2. Incubare le perle per una notte a RT, lavare 3 volte con tampone fosfato, risospendere in 50 μl di tampone fosfato e conservare a 4 °C.
4. Rivestimento delle perle rivestite SA con una proteina biotinilata
   1. Mescolare 5 μl di perle rivestite di SA con la proteina (volume che dipende dalla densità di rivestimento desiderata) e aggiungere il tampone fosfato per ottenere un volume finale di 100 μl.
   2. Incubare la miscela per una notte a 4 °C o per 3 ore a RT, lavare 3 volte con tampone fosfato e risospendere in 50 μl di tampone fosfato e conservare a 4 °C.

4. Preparazione delle cellule

NOTA: Per purificare le cellule, segui i protocolli standard di purificazione delle cellule corrispondenti al tipo di cellule in uso, ad esempio, cellule T o determinate linee cellulari.

1. Per gli esperimenti con fBFP, una volta preparata la sospensione cellulare, aggiungere Fura2-AM (Material list) disciolto in DMSO nella sospensione cellulare per raggiungere una concentrazione finale di 2 μM, incubare per 30 minuti a RT e quindi lavare una volta. Tenere questa sospensione di celle caricata con fluorescenza al buio fino all'uso.

5. Preparazione per micropipette e una camera cellulare

1. Preparazione delle micropipette
   1. Tagliare lunghi tubi di vetro capillari (Elenco dei materiali) con un tagliavetro in pezzi corti di circa 3 pollici di lunghezza. Montare un pezzo sull'estrattore per micropipette (elenco dei materiali), fare clic sul pulsante "Tira" in modo che il centro del capillare venga riscaldato dalla macchina e il capillare venga tirato sulle due estremità per creare due capillari con punte affilate (micropipette grezze).
      nota: Seguendo le linee guida del prodotto, la morfologia desiderata della pipetta grezza ha una conicità di 6-8 mm e un puntale da 0,1-0,5 μm.
   2. Montare una pipetta grezza sul supporto della micropipetta (Lista dei materiali). Scaldare per sciogliere la sfera di vetro sulla forgia. Inserire la punta della pipetta grezza all'interno della sfera di vetro. Raffreddare la sfera di vetro e tirare la pipetta grezza per romperla dall'esterno e lasciare la punta all'interno della sfera. Ripetere questa procedura fino ad ottenere l'orifizio della punta desiderato.
      nota: Esempi di diametro interno della punta di una micropipetta: 2,0-2,4 μm per un globuli rossi, ~1,5 μm per un microsfone, ~2-4 μm per una cellula T e -7 μm per una cellula di ibridoma.
2. Costruire una camera cellulare
   NOTA: la camera della cella è costruita sulla base di un supporto per camera fatto in casa, che consiste in due pezzi di quadrati di metallo (rame/alluminio) e una maniglia che li collega tra loro (Figura 1D).
3. Tagliare un vetrino coprioggetti di 40 mm x 22 mm x 0,2 mm utilizzando un tagliavetro in due pezzi di 40 mm x 11 mm x 0,2 mm (vetrini coprioggetti 1 e 2). Incollare il vetrino coprioggetti 1 con il grasso sul lato superiore del supporto della camera in modo che colleghi i due quadrati di metallo, e allo stesso modo incollare il vetrino coprioggetti 2 sul lato inferiore, che formerà una camera della cella del vetrino coprioggetti parallela (Figura 1D).
4. Utilizzare una pipetta per iniettare 200 μl di tampone sperimentale tra i due vetrini. Assicurarsi che il tampone sia attaccato a entrambi i vetrini. Ruotare delicatamente e scuotere la camera per lasciare che il tampone tocchi entrambe le estremità della camera.
5. Iniettare con cautela l'olio minerale in entrambi i lati della camera, fiancheggiando la zona cuscinetto sperimentale, sigillando così il tampone dall'aria aperta. Iniettare sospensioni di perline di sonda (ad esempio, perle rivestite di pMHC), globuli rossi e bersagli (ad esempio, cellule T) rispettivamente nelle regioni superiore, centrale e inferiore della zona cuscinetto.

4. Esperimento BFP

1. Accendere il microscopio (Elenco materiali) e la sorgente luminosa. Posizionare la camera sul tavolino principale del microscopio (Figura 1A, D).
2. Installare tutte e tre le micropipette di BFP (Figura 1D. A sinistra: sonda, per afferrare un RBC, a destra: bersaglio, per afferrare una cella o una perlina, in basso a destra: aiutante, per afferrare una perlina).
   1. Utilizzare un microiniettore (elenco dei materiali) per riempire una micropipetta con un tampone sperimentale. Togliere il supporto della pipetta (elenco dei materiali) e tenerlo in un punto più basso per consentire all'acqua di gocciolare dal puntale. Inserire rapidamente la micropipetta nel puntale di supporto e assicurarsi che nessuna bolla d'aria penetri nella micropipetta durante l'inserimento. Serrare la vite del supporto.
   2. Montare ciascun portapipetta sul micromanipolatore corrispondente. Spingere la micropipetta verso la camera in modo che i puntali entrino nell'area del tampone della camera. Regola la posizione della micropipetta e trovala sotto il campo visivo del microscopio.
3. Muoviti nello stadio del supporto della camera per trovare le colonie di tre elementi (i globuli rossi, i bersagli e le perline della sonda) uno per uno. Regolare la posizione della micropipetta corrispondente ruotando le manopole dei manipolatori per consentire alla punta della micropipetta di avvicinarsi a una cellula/microsfera. Aspirare la cellula/il cordone regolando la pressione all'interno della micropipetta corrispondente. Tutte e tre le micropipette cattureranno gli elementi corrispondenti.
4. Muoviti all'interno dello stadio portacamera per trovare uno spazio aperto lontano dalle colonie degli elementi iniettati dove verrà eseguito l'esperimento. Cambia la modalità visiva del microscopio per visualizzare l'immagine sul programma del computer sullo schermo del computer. Spostare tutti e tre gli elementi sui puntali delle pipette nel campo visivo del programma.
5. Allineare il tallone della sonda e l'RBC e manovrare con cautela il tallone della sonda fino all'apice dell'RBC, far scorrere brevemente il tallone sull'RBC e ritrarre delicatamente. Regolare la pressione della micropipetta ausiliaria per soffiare via delicatamente il tallone, in modo che rimanga incollato sull'apice dei globuli rossi (Figura 1F). Allontanare la micropipetta ausiliaria e allineare il bersaglio e il cordone della sonda (Figura 2A).
6. Sul programma, nella finestra del campo visivo, utilizzare gli strumenti del programma per misurare i rispettivi raggi della micropipetta della sonda (Rp), l'RBC (R0), l'area di contatto circolare tra l'RBC e il cordone della sonda (Rc), che consente la stima della costante elastica dell'RBC (k) mediante la seguente equazione, dove Δp è la pressione di aspirazione sulla punta della pipetta della sonda. Nota: Segue dalla legge di Hooke che la forza di legame, F, può essere quantificata dal prodotto della costante elastica e dello spostamento del tallone della sonda (d), cioè F = d (Figura 2C).
   
7. Inserire la costante elastica RBC desiderata nel programma (fare riferimento alla sezione 4.6 del protocollo. La costante della molla è tipicamente impostata a 0,25 o 0,3 pN/nm per il saggio di forza di bloccaggio e il saggio di frequenza di adesione e a 0,1 pN/nm per il saggio di fluttuazione termica), che restituirà una pressione di aspirazione richiesta nell'unità di un centimetro d'acqua. Regolare l'altezza del serbatoio dell'acqua che si collega alla pipetta della sonda fino a raggiungere la pressione di aspirazione richiesta.
8. Disegna una linea orizzontale attraverso l'apice RBC, che produrrà una curva nella finestra adiacente che indica la luminosità (valore della scala di grigi) di ogni pixel lungo questa linea. Trascinare la linea di soglia in modo che si trovi a circa la metà della profondità della curva (Figura 2A, B).
   nota: Il punto minimo sulla curva di luminosità al di sotto della linea di soglia indica la posizione del bordo del cordone, quindi è consentito un solo minimo locale. Se attualmente sono presenti due o più minimi locali, significa che l'immagine non è ottimale (probabilmente a causa del fatto che l'immagine è sfocata o di uno scarso allineamento tra il cordone della sonda e l'RBC).
9. Selezionare la modalità di esperimento desiderata: saggio di fluttuazione termica, saggio di frequenza di adesione o saggio di force clamp. Impostare i parametri come desiderato (ad es. forza di urto = 15 pN, velocità di carico = 1.000 pN/s, tempo di contatto = 1 sec, forza di serraggio = 20 pN (per il test di forza di serraggio), ecc.).
   1. Fare clic su "Avvia", che consente al programma di spostare la pipetta target e di guidare il target dentro e fuori dal contatto con la sonda (per i dettagli, vedere la sezione Risultati rappresentativi). In parallelo verrà eseguita la raccolta dei dati, che registra la posizione del cordone della sonda in tempo reale. Arrestare il programma cliccando sul pulsante "Interrompi esperimento", a quel punto si aprirà una finestra per consentire il salvataggio dei dati acquisiti.

Risultati

Figura 1: assemblaggio fBFP.

(A) Un'immagine panoramica del sistema hardware fBFP. (B) Un disegno schematico del sistema hardware fBFP. (C) Il sistema a doppia camma "DC2" (arancione) su cui sono state montate la telecamera ad alta velocità (blu) e una telecamera a fluorescenza (bianca). (D) Il tavolino d...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fosfato di sodio monobasico monoidrato (NaH2PO4 • H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Preparazione del tampone fosfato
Anhy. Fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907	Preparazione del tampone fosfato
Carbonato di sodio (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	Episodio 2127	Preparazione del tampone carbonato/bicarbonato
Bicarbonato di sodio (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	Episodio 5761	Preparazione del tampone carbonato/bicarbonato
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Preparazione del tampone N2-5%
Cloruro di potassio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Preparazione del tampone N2-5%
Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655	Preparazione del tampone N2-5%
saccarosio	Sigma-Aldrich	S0389	Preparazione del tampone N2-5%
MAL-PEG3500-NHS	JenKem	A5002-1	Funzionalizzazione delle perline
Biotina-PEG3500-NHS	JenKem	Codice: A5026-1	Biotinilazione dei globuli rossi
Nistatina	Sigma-Aldrich	N6261	Regolazione dell'osmolarità dei globuli rossi
Idrossido di ammonio (NH4OH)	Sigma-Aldrich	A-6899	Silanizzazione con perle di vetro
metanolo	BDH	67-56-1	Silanizzazione con perle di vetro
30% di perossido di idrogeno (H2O2)	J. T. Barker	Gennaio-86	Silanizzazione con perle di vetro
Acido acetico (glaciale)	Sigma-Aldrich	ARK2183	Silanizzazione con perle di vetro
3-mercaptopropiltrimetossisilano (MPTMS)	Specialità Uct, llc	4420-74-0	Funzionalizzazione di perle di vetro
Perle di vetro borosilicato	Tecnologia delle particelle Distrilab	9002	Funzionalizzazione di perle di vetro
Streptavidina-Maleimmide	Sigma-Aldrich	S9415	Funzionalizzazione di perle di vetro
Bsa	Sigma-Aldrich	Codice A0336	Funzionalizzazione del ligando
Fura2-AM	Tecnologie per la vita	F-1201	Carico intracellulare di colorante a fluorescenza di calcio
Dimetilsolfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Carico intracellulare di colorante a fluorescenza di calcio
Perline Quantibrite PE	BD Bioscienze	340495	Quantificazione della densità
Tubo capillare 0,7-1,0 mm x 30 pollici	Inseguimento di Kimble	Codice 46485-1	Produzione di micropipette
Estrattore per micropipette fiammante/marrone	strumento sutter	P-97	Produzione di micropipette
Narishige	Narishige	Narishige	Produzione di micropipette
olio minerale	Fisher Scientifico	BP2629-1	Assemblaggio della camera
Vetro di copertura del microscopio	Fisher Scientifico	12-544-G	Assemblaggio della camera
Microiniettore	Strumenti di precisione mondiali	MF34G-5	Assemblaggio della camera
Siringa da 1 ml	Bd	309602	Assemblaggio della camera
Porta micropipette	Narishige	HI-7	Assemblaggio della camera
Microscopio (TiE invertito)	Nikon	MEA53100	Sistema BFP
Obiettivo CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg)	Nikon	MRH00401	Sistema BFP
Telecamera, GE680, 640 x 480, GigE, CCD da 1/3", mono	Graftek Imaging	02-2020C	Sistema BFP
Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", attacco C, 1280 x 960, mono., CCD, ADC a 12 bit	Graftek Imaging	02-2185A	Sistema BFP
Testa di sonda submicronica manuale con telecomando ad alta risoluzione	Karl Suss	PH400	Sistema BFP
Tavolo antivibrante (5' x 3')	Catalogo TMC	77049089	Sistema BFP
Tavolino di traslazione manuale 3D	Newport	462-XYZ-M
Software CAD 3D SolidWorks	Software CAD 3D SolidWorks	Versione 2012 SP5	Sistema BFP
Software LabVIEW	Strumenti nazionali	Versione 2009	Sistema BFP, programma BFP
Tavolino piezotraslare 3D	Physik Instrumente	M-105.3P	Sistema BFP
Accuator piezoelettrico lineare	Physik Instrumente	P-753.1CD	Sistema BFP
Tampone carbonato/bicarbonato (pH 8,5)			8,4 g/L di carbonato di sodio (Na2CO3), 10,6 g/L di bicarbonato di sodio (NaHCO3)
tampone N2-5% (pH 7,2)			27,6 g/L di NaFosfato monobasico (NaH2PO4 • H2O), 28,4 g/L di Anhy. NaFosfato bibasico (Na2HPO4)
			20,77 g/L di cloruro di potassio (KCl), 2,38 g/L di cloruro di sodio (NaCl), 0,13 g/L di fosfato di potassio monobasico (KH2PO4), 0,71 g/L di fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4), 9,70 g/L di saccarosio