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1. Purificazione della GTPasi con tag GST
- Coltura di un ceppo di E. coli come BL21 trasformato con pGEX-Rac1 O/N a 37 °C, agitando a 220 giri/min, in 500 ml di terreno di autoinduzione (25 mM Na2HPO4, 25 mM KH2PO4, 50 mM NH4Cl, 5 mM Na2SO4, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0,5% Glicerolo, 0,05% Glucosio, 0,2% Lattosio, 5 g Triptone, 2,5 g Estratto di lievito, 100 μg/ml Ampicillina).
- Raccogliere i batteri mediante centrifugazione per 10 minuti a 10.000 x g, 4 °C.
- Risospendere il pellet batterico in 20 ml di reagente per l'estrazione proteica, 1x inibitore della proteasi e incubare per 20 minuti a RT con inversione.
- Chiarificare il lisato mediante centrifugazione a 40.000 x g per 30 min.
- Aggiungere 2 ml di perle magnetiche di glutatione, lavate con soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS: 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
- Incubare per 2 ore, mescolando per inversione a 4 °C.
- Lavare le perle cariche di proteine quattro volte con 10 ml di PBS, utilizzando un selezionatore di particelle magnetiche per far precipitare le perle ad ogni passaggio.
- Risospendere le perle caricate di proteine in 2 ml di PBS e conservarle a -80 °C in aliquote da 100 μl fino al momento del bisogno.
2. Espressione di proteine leganti la GTPasi
- Il giorno prima dell'esperimento, i plasmidi che codificano le versioni marcate con la proteina fluorescente verde (GFP) di ciascuna proteina legante la GTPasi in un pallone separato di 75 cm2 di HEK293T come segue. Per la convalida del carico nucleotidico, trasfettare TrioD1 marcato con GFP in un terzo pallone di HEK293T da 75cm2.
- Diluire la polietilammina a 1 mg/ml in 100 μl di NaCl sterile 150 mM.
- Aggiungere 27 μl di polietilammina diluita a 223 μl di terreno sierologico ridotto.
- Aggiungere 12 μg di DNA plasmidico a 250 μl di terreno sierologico ridotto.
- Incubare ogni provetta per 2 minuti a RT.
- Unire le miscele di polietilammina e DNA in un unico tubo e vorticare per 2 minuti.
- Incubare per 15-20 minuti a RT.
- Sostituire i terreni di crescita (Dulbecco's Modified Eagle Media, 10% siero fetale bovino, 2 mM di L-glutammina, nessun antibiotico) con HEK293T confluente al 90% con 5 ml di terreno di crescita fresco.
- Aggiungere la miscela combinata di polietilammina/DNA al pallone e incubare O/N a 37 °C, 5% CO2.
3. Purificazione delle proteine leganti la GTPasi
- Sciacquare i matracci di cellule trasfettate in PBS e scolare il pallone per 5 minuti, aspirando il liquido libero.
- Raschiare le cellule in 500 μl di tampone di lisi (50 mM di Tris-HCl (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1x inibitore della proteasi) in una provetta per microfuge.
- Lisi le cellule mescolando per inversione a 4 °C per 30 min.
- Durante la lisi, lavare tre volte due lotti di perle GFP-Trap da 40 μl con un tampone di lisi fresco, sedimentando le microsfere a 2.700 x g per 2 minuti tra un lavaggio e l'altro.
- Chiarificare i lisati mediante centrifugazione a 21.000 x g per 10 min.
- Trasferire il lisato chiarificato di ciascuna delle proteine concorrenti per separare le perle GFP-trappola lavate e consentire alle proteine di fusione GFP di legarsi per 2 ore, mescolandosi per inversione a 4 °C. Mantenere il lisato dalle cellule GFP-TrioD1 sul ghiaccio.
- Lavare due volte le microsfere GFP-Trap caricate con 50 mM di Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM di NaCl, 0,7% (p/v) di Nonidet P-40 e due volte con 50 mM di Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM di MgCl2, sedimentando le microsfere a 2.700 x g per 2 minuti tra un lavaggio e l'altro.
- Eluire le proteine di fusione GFP aggiungendo 40 μl di glicina 0,2 M (pH 2,5) e pipettando su e giù per 30 sec. Sedimentare immediatamente le perle a 21.000 x g per 60 s e trasferire il liquido in una nuova provetta microfuge contenente 4 μl di Tris-HCl 1 M (pH 10,4). Fallo rapidamente per limitare i danni alla proteina purificata.
- Analizzare 1 μl di ciascuna proteina purificata mediante Western blot e sondare con un anticorpo anti-GFP per stabilire la resa relativa utilizzando un sistema di blotting quantitativo secondo il protocollo del produttore. In alternativa, determinare le concentrazioni proteiche mediante il saggio dell'acido bicinchoninico (BCA), ma ciò introduce errori se le proteine non reagiscono con il test in modo identico o se sono presenti proteine contaminanti.
- Equalizzare la concentrazione di proteine molari mediante l'aggiunta di 50 mM di Tris-HCl (pH 7,6) e 20 mM di MgCl2.
4. Caricamento nucleotidico della GTPasi
- Scongelare un'aliquota di perline magnetiche GST-Rac1, preparata al punto 1.
- Prelevare 90 μl di perle GST-Rac1 e lavare tre volte con 20 mM di Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM di NaCl, 0,1 mM di DTT e 4 mM di EDTA, utilizzando un selezionatore di particelle magnetiche per far precipitare le microsfere ad ogni passaggio.
- Aspirare il tampone dalle perle e aggiungere 100 μl di Tris-HCl 20 mM (pH 7,6), 25 mM di NaCl, 0,1 mM di DTT e 4 mM di EDTA.
- A seconda che per l'esperimento della competizione sia richiesto un carico di GDP, GTP o nessun carico nucleotidico, aggiungere 12 μl di GDP 100 mM, 12 μl di guanosina 5'-[γ-tio]trifosfato (GTPγS) o nessun nucleotide a 60 μl di perle GST-Rac1.
- Per i controlli di caricamento dei nucleotidi, dividere le perle rimanenti in tre aliquote da 10 μl e aggiungere 2 μl di GDP da 100 mM, 2 μl di GTPγS da 10 mM o nessun nucleotide a ciascuna provetta.
- Incubare le miscele di perle per 30 minuti a 30 °C con agitazione.
- Stabilizzare Rac1 legato ai nucleotidi aggiungendo 1 M di MgCl2: 3 μl alla miscela sperimentale (fase 4.4) e 0,5 μl a ciascuna delle miscele di controllo (fase 4.5).
5. Vincolo per la competizione
- Prepara 6 tubi per microfuge, ciascuno contenente:
200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 μl di perle sperimentali di Rac1 caricate con nucleotidi (dal passaggio 4.7)
5 μl di proteina legante Rac1 A (proteina a legame costante)
- A ciascuna provetta, aggiungere 0, 1, 2,5, 5, 10 o 20 μl di proteina B legante Rac1 (proteina legante variabile). Questi volumi assumono concentrazioni di stock approssimativamente uguali delle proteine leganti costanti e variabili e potrebbe essere necessario aggiustarli.
- Regolare i volumi delle proteine leganti A e B se ci sono grandi differenze nelle affinità di legame delle due proteine e questo dovrebbe essere determinato empiricamente attraverso le ripetizioni sperimentali. Portare il volume totale della miscela legante a 235 μl con l'aggiunta di 50 mM di Tris-HCl (pH 7,6) e 20 mM di MgCl2.
- Installa un tubo per microfuge contenente:
200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
10 μl di perle sperimentali di Rac1 caricate con nucleotidi (dal passaggio 4.7)
10 μl di proteina legante Rac1 A (proteina a legame costante)
- Impostare le provette di controllo GDP, GTPγS e no nucleotide:
200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2
Perle di controllo Rac1 da 10 μl caricate al passo 4.5 con GDP, GTPγS o nessun nucleotide e stabilizzate al passo 4.7.
180 μl HEK293T di lisato GFP-TrioD1, preparato come al punto 3.6
4 μl 1 M MgCl2
- Incubare la miscela per 2 ore, mescolando per inversione a 4 °C.
- Lavare le perle tre volte con 50 mM di Tris-HCl (pH 7,6) e 20 mM di MgCl2.
- Eluire le proteine legate in 20 μl di tampone riducente del campione (50 mM di Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% di glicerolo, 0,02 mg/ml di blu di bromofenolo, 5% di β-mercaptoetanolo).