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1. Produci microarray di antigeni influenzali
- Stampa di antigeni su vetrini microarray
- Ricostituire ciascun antigene liofilizzato a una concentrazione di 0,1 mg/mL in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con 0,001% di Tween-20 (T-PBS). Trasferire 10 μl di ciascun antigene ricostituito in pozzetti individuali di una piastra a fondo piatto a 384 pozzetti non trattata.
- Stampa gli antigeni utilizzando una stampante per microarray con perni di spotting per microarray a basso volume che aspirano l'antigene nel canale del campione e lo depositano per contatto diretto e azione capillare su vetrini rivestiti in nitrocellulosa a 16 tamponi.
- Programmare il software di stampa (ad es. Gridder) con la configurazione della lastra di origine e i parametri di stampa.
- Utilizzare il menu a discesa per selezionare il nome del tipo di lastra che verrà utilizzato con questo metodo di stampa. Per questo studio, utilizzare una piastra a fondo piatto a 384 pozzetti non trattata.
- Selezionare la casella di testo accanto a Numero di lastre e digitare il numero di lastre campione che verranno utilizzate in questo protocollo di stampa. Per questo studio, utilizzare 1 piastra.
- Selezionare una configurazione pin da utilizzare con questo metodo. Per questo studio, utilizzare una configurazione a 8 pin.
- Assicurarsi che gli offset di origine siano le distanze (nelle direzioni X e Y) tra l'origine della diapositiva (calibrata nella sezione Amministrativa) e la posizione in cui i pin di stampa inizieranno a stampare sulle diapositive.
- Utilizzando la scheda Progettazione array, definire la dimensione e la forma degli array (spaziatura dei punti e numero di punti per sottoarray). Per questo studio, è possibile stampare 324 punti (diametro 180 μm con spaziatura di 300 μm) su vetrini da 16 pad in formato 18x18 utilizzando 8 pin.
- Selezionare i parametri per il modo in cui i pin di stampa prelevano ed erogano i campioni. Per questo studio, ogni pin aspira 250 nL di soluzione antigenica e stampa 1 nL su ciascuno dei 40 punti (totale di 20 vetrini per tutti gli 8 pin)
- Configurare il protocollo di pulizia dei pin e il protocollo di blotting. Per questo studio, ogni pin stampa l'antigene, viene immerso in ddH2O sterile in un contenitore di lavaggio sonicato e quindi aspira l'antigene successivo.
- Definisce la sequenza in cui i blocchi campione vengono stampati sui vetrini. Il software dell'array costruirà un file indice a griglia annotato (.gal) per descrivere la disposizione degli antigeni all'interno di ciascun microarray.
nota: La riga superiore viene utilizzata per i fiduciali (con fluorescenza a tutte le lunghezze d'onda utilizzate nell'imaging, ad esempio, un mix di coniugato di streptavidina Qdot 585 nm e coniugato streptavidina Qdot 800 nm in questo studio) per orientare le griglie durante l'imaging. Per lunghe tirature di stampa, gli antigeni nella piastra di origine possono essere periodicamente sospesi pipettandoli su e giù e quindi centrifugandoli, oppure è possibile preparare e utilizzare una nuova piastra di origine.
- Collocare i vetrini per microarray non sondati in una scatola a prova di luce e conservarli in un armadio essiccatore a temperatura ambiente per la conservazione a lungo termine.
nota: A questo punto, il protocollo potrebbe essere sospeso a tempo indeterminato.
- Eseguire il controllo di qualità (richiede etichette in poliistidina)
- Fissare il vetrino alle camere di tastatura e reidratarlo con un tampone bloccante come descritto nei passaggi 2.1.1-2.1.2 e mostrato nella Figura 1.
- Diluire l'anticorpo poli-His monoclonale di topo 1:100 in tampone bloccante filtrato 1x.
nota: Se gli antigeni proteici non purificati (ad esempio, espressi nel sistema di trascrizione e traduzione in vitro) vengono utilizzati direttamente per stampare microarray, aggiungere componenti del sistema di espressione proteica (ad esempio, lisato di E. coli) in un rapporto di 1:10 con il tampone bloccante utilizzato per la diluizione del siero al fine di bloccare eventuali anticorpi diretti contro questi componenti.
- Aggiungere 100 μl di anticorpo poli-His diluito a ciascuna camera di vetrini contenente il tampone dell'array dopo l'aspirazione e incubare per 2 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C su un agitatore. Lavare 3 volte con tampone T-TBS come descritto al punto 2.2.1. Diluire l'anticorpo secondario IgG di capra coniugato con biotina 1:200 in tampone bloccante, aggiungere 100 μl per pozzetto dopo l'aspirazione e incubare per 1 ora a temperatura ambiente su un agitatore. Lavare 3 volte con tampone T-TBS.
- Diluire la streptavidina coniugata Qdot 585 nm a 4 nM in tampone bloccante, aggiungere 100 μl per pozzetto dopo l'aspirazione e incubare per 1 ora a temperatura ambiente sull'agitatore. Lavare 3 volte con tampone T-TBS e poi una volta con tampone TBS (senza Tween).
- Smontare e quantificare i vetrini come descritto nei passaggi 2.2.5 – 3.1.2.
nota: Gli antigeni proteici devono contenere tag His10 per utilizzare questo protocollo di controllo qualità. In alternativa, se è incluso un tag diverso, è possibile eseguire un controllo di qualità con un anticorpo o un ligando per quel tag.
2. Sonda i sieri per gli anticorpi dell'influenza utilizzando i microarray
- Incubare i sieri su microarray per il legame degli anticorpi.
- Fissare i vetrini per microarray alle camere utilizzando le clip e posizionarli in cornici come mostrato nella Figura 2.
nota: Evitare sempre di toccare il pad del microarray con le mani e gli strumenti. Assicurarsi che le guide siano orientate con il lato del pad rivolto verso l'alto e la piccola tacca nell'angolo in alto a destra.
- Reidratare i vetrini di microarray con 100 μl per pozzetto di tampone bloccante filtrato 1x e diluire il siero 1:100 in 100 μl di tampone bloccante (è possibile utilizzare piastre da 96 pozzetti non trattate o provette da 2 mL). Incubare separatamente sia i vetrini di microarray reidratati in telai coperti che i sieri diluiti separatamente per 30 minuti a temperatura ambiente su un agitatore orbitale a 100-250 giri/min. Eseguire tutte le fasi di incubazione successive in modo simile sullo shaker.
nota: I sieri devono essere aliquotati e congelati a -80 °C per la conservazione a lungo termine per ridurre al minimo i cicli di gelo-disgelo e devono essere agitati per miscelare e centrifugati per rimuovere il particolato prima dell'uso. Osservare attentamente le camere dei vetrini durante e dopo questo passaggio per rilevare eventuali perdite che richiedono il rimontaggio delle camere dei vetrini.
- Utilizzando i puntali delle pipette collegati a una linea del vuoto con un pallone di raccolta secondario, aspirare con cautela il tampone di blocco dall'angolo di ciascuna camera senza toccare i cuscinetti. Eseguire tutte le fasi di aspirazione successive in modo analogo. Aggiungere rapidamente i sieri diluiti agli elettrodi dopo l'aspirazione per evitare che gli assorbenti si asciughino.
- Posizionare i telai coperti in vassoi all'interno di un contenitore secondario circondato da carta assorbente umida e sigillato per evitare l'evaporazione. Incubare per una notte a 4 °C su un agitatore a dondolo (in alternativa, può incubare per 2 ore a temperatura ambiente su un agitatore orbitale a 100-250 giri/min).
- Anticorpi sierici legati all'etichetta con anticorpi secondari coniugati con punti quantici
- Aspirare attentamente i sieri dalle camere come descritto sopra, aggiungere 100 μL per pozzetto di tampone T-TBS (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20 in ddH2O regolato a pH 7,5 e filtrato, possono essere ottenuti in commercio) e incubare per 5 minuti su un agitatore orbitale a 100-250 giri/min. Ripetere questa fase di lavaggio per un totale di 3 volte (tutte le fasi di lavaggio successive vengono eseguite in modo simile).
- Preparare una miscela di anticorpi secondari diluiti a 1 μM in tampone bloccante e miscelare accuratamente mediante pipettaggio prima e durante l'uso per mantenere l'omogeneità.
nota: Per mantenere la riproducibilità del saggio, lo stesso lotto di ciascun anticorpo secondario deve essere utilizzato per tutti gli esperimenti di sondaggio per i quali è previsto il confronto quantitativo dei dati tra gli esperimenti. Potrebbe essere necessario variare la concentrazione specifica dell'anticorpo secondario a seconda dell'affinità; Seguire i protocolli del produttore quando disponibili.
- Aspirare il tampone dalle camere dopo il lavaggio finale, aggiungere 100 μl per pozzetto di miscela di anticorpi secondari e incubare per 2 ore a temperatura ambiente su un agitatore.
- Aspirare la miscela di anticorpi secondari, lavare 3 volte con tampone T-TBS, quindi lavare una volta con tampone TBS (senza Tween).
- Smontare accuratamente i vetrini dei microarray dalle camere per evitare di toccare i tamponi, sciacquare delicatamente con ddH2O filtrato e asciugarli mettendoli in provette da 50 mL e centrifugando a 500 x g per 10 minuti.
- Collocare i vetrini per microarray sondati in una scatola a prova di luce e conservarli in un armadio essiccatore a temperatura ambiente per la conservazione a lungo termine.
nota: A questo punto, il protocollo può essere messo in pausa per un massimo di 1 settimana.
3. Quantificare il legame degli anticorpi agli antigeni all'interno del microarray
- Visualizzazione di vetrini di microarray e quantificazione dell'intensità della fluorescenza spot per misurare il legame con gli anticorpi.
- Acquisizione di immagini di vetrini microarray utilizzando l'imager portatile con software integrato.
- Nella scheda Configura imager, selezionare la configurazione corretta del vetrino. Per questo studio, utilizzare diapositive da 16 pad.
- Nella scheda Controllo immagine, selezionare il canale fluorescente appropriato e regolare il guadagno, il tempo di esposizione e il tempo di acquisizione in base alla reattività dei sieri per ottenere immagini ottimali. Per questo studio, i canali fluorescenti per IgA e IgG erano rispettivamente di 585 nm e 800 nm e le impostazioni di imaging erano un guadagno di 50, un tempo di esposizione di 500 ms e un tempo di acquisizione di 1 s.
- Fare clic su Cattura per avviare il processo di acquisizione dell'immagine.
nota: I vetrini di microarray possono essere ri-ri-acquisiti con più impostazioni senza degradazione dei segnali, purché siano conservati al buio e all'asciutto. È possibile utilizzare altri sistemi di imaging se compatibili con i vetrini.
- Rileva gli spot dell'array utilizzando griglie orientate in base ai marcatori fiduciali e misura l'intensità dello spot come la mediana dell'intensità dei pixel meno lo sfondo misurato intorno agli spot. Esegui questo algoritmo di quantificazione in batch utilizzando il software imager integrato, che utilizza il file .gal costruito nel passaggio 1.1.2 per collegare le intensità spot ai singoli antigeni su ciascun microarray.
- Nel pannello Info file, caricare il file .gal selezionandolo dalla relativa cartella sul computer e specificare la cartella in cui salvare i file di output dell'analisi nella sezione Opzioni di analisi.
- Nella scheda Controllo immagine, aprire una delle immagini acquisite da quantificare e selezionare il pulsante Auto nell'angolo in alto a destra.
- Nella sezione Analisi array nell'angolo in basso a destra, creare un modello fiduciale come indicato dal software.
- Fare clic su Analisi batch, selezionare la cartella che contiene le immagini da quantificare e selezionare il modello fiduciale creato nel passaggio precedente. Il software analizza ogni immagine e quantifica l'intensità dello spot.
nota: Questa fase genererà un file .csv contenente intensità spot che quantificano gli anticorpi all'interno di ciascun campione di siero che si legano a ogni singolo antigene sul microarray che può essere successivamente manipolato in un software di manipolazione o analisi su foglio di calcolo.
- Analizza i dati grezzi per confrontare il legame degli anticorpi tra gli antigeni e tra i campioni di siero. Per questo studio, gli anticorpi IgA e IgG misurati come intensità di spot fluorescenti di 585 nm e 800 nm sono stati confrontati tra tutti gli antigeni tra 2 esecuzioni indipendenti dell'esperimento utilizzando vetrini diversi in giorni diversi ed è stata eseguita un'analisi di correlazione per misurare la riproducibilità del test><.
nota: Per le proteine non purificate stampate come miscela di espressione, l'analisi dei dati dovrebbe iniziare con la sottrazione di fondo di nessun controllo del DNA.
