Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Isolamento di monociti umani primari mediante selezione immunomagnetica negativa
- Raccogliere 40 ml di sangue intero umano fresco (da un paziente HIV+ o da un controllo sano) in quattro provette a vuoto da 10 ml di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (10 ml di sangue per provetta). Utilizzando tecniche sterili sotto una cappa di biosicurezza, trasferire tutti i 40 mL di sangue in una provetta conica di propilene da 50 mL.
- Seguendo il protocollo del produttore per il kit di isolamento dei monociti umani selezionato (Tabella dei materiali), aggiungere 2 mL di cocktail di isolamento dei monociti, forniti nel kit, alla provetta di sangue. Vortex microsfere magnetiche, fornite anche nel kit, per 30 s, e aggiungere 2 mL alla provetta di sangue.
- Se sono disponibili meno di 40 ml di sangue, ridurre i reagenti aggiunti. Per miscelare la soluzione, pipettare su e giù con una pipetta sierologica di plastica da 25 ml e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Separare la miscela di sangue in parti uguali in quattro provette da 50 mL e aggiungere 30 mL di soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS) contenente 1 mM di EDTA a ciascuna provetta. Miscelare pipettando su e giù con una pipetta sierologica di plastica da 25 ml.
- Posizionare i tubi nei supporti magnetici per 10 minuti per rimuovere le perle magnetiche coniugate con anticorpi. Utilizzare quattro supporti magnetici contemporaneamente, uno per ogni provetta, per consentire tempi di incubazione e isolamento costanti per ogni campione di sangue.
- Prelevare il contenuto dal centro di ogni provetta, utilizzando una pipetta, mentre è ancora nei supporti magnetici. Fare attenzione a non prelevare globuli rossi (non più del 10% del volume iniziale di 10 ml) e inserire il contenuto in una delle quattro nuove provette da 50 ml.
- Aggiungere 500 μL di microsfere magnetiche vortex a ciascuna provetta da 50 mL. Pipettare su e giù con una pipetta da 25 ml e incubare a RT per 5 minuti. Quindi, posizionare i tubi nei supporti magnetici per 5 minuti.
- Trasferire con cura il contenuto dal centro di ogni provetta mentre è ancora nei supporti magnetici in una delle quattro nuove provette da 50 mL. Posizionare direttamente ogni nuova provetta da 50 mL nei supporti magnetici per 5 minuti.
- Trasferire con cautela il contenuto dal centro di ciascuna provetta in una delle quattro nuove provette da 50 mL. Centrifugare tutte le nuove provette da 50 mL a 300 x g per 5 min. Aspirare il surnatante e risospendere tutti e quattro i pellet cellulari per un totale di 10 mL di PBS sterile.
- Contare le cellule mediante esclusione del blu di tripano utilizzando un emocitometro.
NOTA: 8-20 x 106 cellule sono generalmente ottenute da 40 ml di sangue intero.
2. Coltura di monociti umani primari
- Utilizzando un bagno d'acqua a 37 °C, i terreni RPMI 1640 caldi e privi di siero, integrati con penicillina-streptomicina all'1% (penna/streptococco) e (pur continuando a utilizzare tecniche sterili in una cappa di biosicurezza) risospendere i monociti isolati in questo terreno a una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL.
- Aggiungere 1 mL di cellule risospese a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti o in una piastra da 35 mm (il numero finale di cellule deve essere 1 x 106 cellule/piastra) e collocare in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2. Attendere 0,5-1,0 ore affinché le celle aderiscano.
- Utilizzando un bagno d'acqua a 37 °C, riscaldare il siero fetale bovino (FBS) inattivato al calore (HI). Aggiungere 100 μl (concentrazione finale del 10%) di FBS a ciascuna piastra. Aggiungere fattori di crescita alle cellule per promuovere la differenziazione dei macrofagi.
- Primeggiare i macrofagi per un fenotipo simile a M1 aggiungendo 25 ng/mL di fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) ai terreni. Primeggiare i macrofagi per un fenotipo simile a M2 aggiungendo 50 ng/mL di fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) a media.
nota: Sia GM-CSF che M-CSF consentono la differenziazione dei monociti in un fenotipo generale dei macrofagi (M0) mentre innescano le cellule rispettivamente per M1 o M2.